石斑魚(yú)虹彩病毒(SGIV)DNA疫苗的篩選及囊膜蛋白VP16的特征分析.pdf

1、近年來(lái)，高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展帶來(lái)了水環(huán)境污染的日益加劇，致使各種水產(chǎn)病害特別是病毒性疾病大規(guī)模爆發(fā)，給魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。新加坡石斑魚(yú)虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)就是一種從養(yǎng)殖的石斑魚(yú)中分離到的水產(chǎn)動(dòng)物重要病毒病原。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)是進(jìn)行魚(yú)類(lèi)病毒分離繁殖，進(jìn)而研究魚(yú)類(lèi)病毒的致病機(jī)理、病毒宿主相互作用以及研制疫苗的最基礎(chǔ)一步。而疫苗作為化學(xué)藥品和抗生素的替代品，是治療疾病、特別

2、是病毒病的最好選擇。本研究建立了赤點(diǎn)石斑魚(yú)肝組織細(xì)胞系，同時(shí)根據(jù)SGIV全基因組序列信息，運(yùn)用反向疫苗學(xué)分析方法，從大量的病毒編碼基因中鑒定到了3個(gè)能產(chǎn)生明顯保護(hù)作用的基因，同時(shí)對(duì)SGIV囊膜蛋白VP16的分子特征進(jìn)行了分析。結(jié)果簡(jiǎn)述如下：
　　 1)赤點(diǎn)石斑魚(yú)肝組織細(xì)胞系的建立與特征分析。細(xì)胞在溫度25-30℃、含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中增殖良好。在25℃培養(yǎng)條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)速率隨著血清濃度(5-20％)的升高而增加，最

3、佳血清濃度為15-20％。染色體分析顯示特征染色體數(shù)目為48條。本研究進(jìn)一步分析了細(xì)胞對(duì)4種魚(yú)類(lèi)病毒的敏感性，結(jié)果顯示僅有SGIV感染的細(xì)胞觀察到了明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)，免疫熒光和電鏡觀察進(jìn)一步確認(rèn)了細(xì)胞的SGIV敏感性。細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N3質(zhì)粒后觀察到了明顯的綠色熒光，說(shuō)明此細(xì)胞系能夠用于轉(zhuǎn)基因和基因遺傳操作。
　　 2)SGIV DNA疫苗候選基因的鑒定。運(yùn)用反向疫苗學(xué)的分析方法，利用一系列生物信息學(xué)工具從SGIV全基因組

4、序列中篩選到了13個(gè)疫苗候選基因，克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1，免疫石斑魚(yú)幼魚(yú)，鑒定到了3個(gè)能產(chǎn)生明顯保護(hù)作用的基因。
　　 3)SGIV VP16的克隆及分子特征分析。從SGIV全基因組中克隆了VP16編碼基因全長(zhǎng)，原核表達(dá)純化并免疫小鼠制備了抗體。序列分析表明，VP16編碼基因是蛙病毒屬特有的基因。RT-PCR、Western-blot分析與藥物抑制實(shí)驗(yàn)揭示該基因是一個(gè)晚期基因。免疫熒光觀察結(jié)果表明，VP16在感染細(xì)胞