石斑魚(yú)虹彩病毒(SGIV)ORF112編碼類膠原結(jié)構(gòu)蛋白的分子特征.pdf

1、新加坡石斑魚(yú)虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是從新加坡養(yǎng)殖石斑魚(yú)中分離的強(qiáng)致病性病原，它可導(dǎo)致石斑魚(yú)高達(dá)90％以上的死亡率，給石斑魚(yú)的養(yǎng)殖造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此研究該病毒功能基因在病毒組裝，復(fù)制和侵染中的作用，可以為了解病毒特性，確定疫苗候選基因提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 經(jīng)過(guò)人類多年來(lái)對(duì)病毒結(jié)構(gòu)和病毒致病機(jī)理的深入研究發(fā)現(xiàn)，囊膜蛋白和帶有修飾基團(tuán)的蛋白，如糖基化和磷酸化的蛋白，一般來(lái)說(shuō)

2、對(duì)病毒的生存起到關(guān)鍵性的作用。類膠原結(jié)構(gòu)蛋白(collagen-like protein,CLP)是一類含有膠原重復(fù)結(jié)構(gòu)Gly-X-Y三肽的蛋白，目前在水生病毒中只有WSSV和LCDV中有報(bào)道，其中WSSV的類膠原結(jié)構(gòu)蛋白已經(jīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)為具有糖基化修飾的病毒囊膜蛋白。
　　 新加坡石斑魚(yú)虹彩病毒(SGIV)是大分子DNA病毒，為雙鏈環(huán)狀DNA，其基因組全長(zhǎng)140,131bp，共有162個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading f

3、rame，ORF)。通過(guò)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，我們?cè)赟GIV中也發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)編碼類膠原結(jié)構(gòu)蛋白的基因：ORF055和ORF112。本論文選擇SGIV ORF112編碼的類膠原結(jié)構(gòu)蛋白CLP112為研究對(duì)象。首先，我們對(duì)ORF112編碼的類膠原結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，鮚果顯示該蛋白有多個(gè)預(yù)測(cè)的糖基化和磷酸化的位點(diǎn)，以及C端一個(gè)由20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。其次，我們研究了CLP112的分子特征：RNA轉(zhuǎn)錄時(shí)序和蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)序?qū)嶒?yàn)表明

4、該基因編碼的是一個(gè)病毒的晚期蛋白；在全病毒蛋白和病毒囊膜蛋白的質(zhì)譜鑒定的基礎(chǔ)上，我們又利用免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)和Western Blot印記確定了該蛋白為病毒的非囊膜結(jié)構(gòu)蛋白；Western Blot結(jié)果表明該蛋白在病毒復(fù)制過(guò)程中大量表達(dá)，其分子量位置也遠(yuǎn)高于通過(guò)蛋白質(zhì)序列本身算得的分子量，說(shuō)明天然的CLP112攜帶有蛋白的修飾基團(tuán)。緊接著，我們檢測(cè)了CLP112的亞細(xì)胞定位和在病毒復(fù)制中的作用。GFP融合蛋白轉(zhuǎn)染和免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致

5、表明CLP112在宿主細(xì)胞中呈胞質(zhì)分布，且在病毒感染后圍繞細(xì)胞核和病毒包涵體呈現(xiàn)不均勻的點(diǎn)塊狀分布；進(jìn)一步的Morpholino Oligo干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示ORF112基因的沉默表達(dá)可以延遲病毒的復(fù)制進(jìn)度。最后的SGIV感染GS的超薄切片結(jié)果也顯示出經(jīng)過(guò)Morpholino oligos干擾的GS細(xì)胞中，病毒的組裝相對(duì)正常細(xì)胞感染的病毒顆粒來(lái)說(shuō)，結(jié)構(gòu)不完整。說(shuō)明，CLP112在病毒的組裝復(fù)制中起到幫助的作用。
　　 根據(jù)以上這些