與宿主細(xì)胞膜蛋白相互作用的石斑魚(yú)虹彩病毒(SGIV)結(jié)構(gòu)蛋白篩選及其VP75的分子表征.pdf

1、病毒結(jié)構(gòu)蛋白在組裝病毒粒子，參與識(shí)別、黏附和侵入宿主細(xì)胞過(guò)程中有重要的作用。病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附和侵入主要通過(guò)病毒粒子表面的黏附蛋白進(jìn)行。石斑魚(yú)虹彩病毒(Singapore Grouper Iridovirus，SGIV)是一種從養(yǎng)殖石斑魚(yú)中新發(fā)現(xiàn)的虹彩病毒，能夠引起海水養(yǎng)殖魚(yú)類的系統(tǒng)性感染及高死亡率，屬虹彩病毒科(Iridoviridae)，蛙病毒屬(Ranavirus)。該病毒是大雙鏈DNA病毒，基因組呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)達(dá)140，131

2、bp，共有162個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)，編碼41-1268個(gè)氨基酸不等的蛋白質(zhì)。 利用Farwesternblotting研究SGIV與宿主細(xì)胞GP細(xì)胞膜蛋白相互作用，獲得2個(gè)候選病毒蛋白。通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸時(shí)間飛行質(zhì)譜(Matrix—assisted laser desorption/ionization time—of—flight tandem mass spectrometry，M

3、ALDI TOF/TOF MS)分析初步鑒定為SGIVVP39和VP75，分別由SGIVORF039L和ORF075R編碼。對(duì)2個(gè)基因產(chǎn)物的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，兩者均不含有跨膜區(qū)和信號(hào)肽序列。VP39在虹彩病毒科內(nèi)具有多個(gè)同源蛋白，對(duì)它們進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域比較發(fā)現(xiàn)，在N’端均包含2個(gè)C—adapt結(jié)構(gòu)域，在C’端均含有蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其功能可能與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)。而VP75含有1個(gè)保守的磷酸化位點(diǎn)，以及糖基化和十二烷基化等修飾

4、位點(diǎn)。這些修飾位點(diǎn)可能與蛋白功能有重要關(guān)系。 通過(guò)設(shè)計(jì)引物對(duì)SGIVORF075R基因進(jìn)行擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出500bp片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pET32a(+)載體，利用大腸桿菌BL21(DE3)株成功表達(dá)出重組VP75蛋白(rVP75)。用經(jīng)腸激酶消化酶切后純化的rVP75免疫BALB/cA小鼠得到多克隆抗體。 對(duì)ORF75R進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)時(shí)相分析，表明該基因?qū)儆谕砥?L)基因，轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均從16h.p.i開(kāi)始，持續(xù)到72h

5、.p.i仍然有高水平的轉(zhuǎn)錄表達(dá)?？贵w中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)VP75抗體未能阻斷病毒的感染。通過(guò)Farwesternblotting和Pulldownassay分析了rVP75與GP細(xì)胞蛋白的相互作用。出乎意外的是，未能檢測(cè)到rVP75與GP細(xì)胞膜蛋白之間的相互作用。之前VP75的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明該蛋白含有磷酸化、糖基化和十二烷基化修飾。糖蛋白染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SGIVVP75染色信號(hào)很強(qiáng)，表明是一種糖蛋白。因此我們推測(cè)SGIVVP75可能在