擬南芥聚ADP-核酸葡聚糖水解酶基因PARG1在抗病和抗逆反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、聚ADP-核酸化是一類(lèi)在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中起重要作用的轉(zhuǎn)錄后蛋白修飾方式。最近研究表明,聚ADP-核酸化也參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)和逆境反應(yīng)。本文利用T-DNA插入突變體和過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系研究了擬南芥聚ADP-核酸葡聚糖水解酶1[poly(ADP-ribose)glycohyrdrolase1,PARG1]基因在灰霉病(Botrytiscinerea,B.cinerea)抗性和非生物逆境反應(yīng)中的作用。
　　 RT-PCR分析結(jié)果表

2、明,B.cinerea侵染擬南芥,植株葉片中PARG1轉(zhuǎn)錄水平逐漸增強(qiáng);光照誘導(dǎo)擬南芥植株葉片中PARG1轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng);黑暗條件下,以水楊酸(salicylic acid,SA)噴霧處理擬南芥植株,SA誘導(dǎo)擬南芥植株P(guān)ARG1轉(zhuǎn)錄水平增強(qiáng),但在處理SA時(shí)遇光照,PARG1基因下調(diào)表達(dá)。茉莉酸(jasmonic acid,JA)、乙烯前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,

3、ACC)不誘導(dǎo)PARG1基因的表達(dá)。35S-GFP：PARG1結(jié)果顯示,PARG1定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。構(gòu)建了PPAPG1：GUS轉(zhuǎn)基因株系,染色結(jié)果顯示,PARG1在擬南芥植株的根尖、葉、花藥內(nèi)表達(dá)。
　　 為了研究PARG1在抗病反應(yīng)中的功能,篩選獲得一個(gè)基于Ws-0生態(tài)型背景的T-DNA插入突變體parg1-3和一個(gè)基于Co1-0生態(tài)型背景的T-DNA插入突變體parg1-4;構(gòu)建了由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基于par

4、g1-3突變體背景的轉(zhuǎn)PARG1基因過(guò)量表達(dá)系,PARG1-OE1/parg1-3和PARG1-OE2/parg1-3,與基于野生型Co1-0背景的轉(zhuǎn)PARG1基因過(guò)量表達(dá)系PARG1-OE1/Co1-0和PARG1-OE2/Co1-0。接著比較分析了上述突變體和過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系接種B.cinerea和番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000)的病害表型。

5、r>　　 噴霧接種B.cinerea或注射接種Pst DC3000后,parg1突變體的病害發(fā)病水平輕于野生型的病害發(fā)病水平,野生型的病害發(fā)病水平則輕于PARG1-OE株系的病害發(fā)病水平。接種病原菌后做菌量測(cè)試,parg1突變體葉片中B.cinerea生長(zhǎng)量和Pst DC3000菌量均低于野生型中相應(yīng)病菌菌量,野生型葉片中B.cinerea生長(zhǎng)量和Pst DC3000菌量均低于PARG1-OE株系葉片的相應(yīng)病菌菌量。B.cinerea

6、侵染后,各株系病程相關(guān)蛋白基因(Pathogenesis-related protein gene,PR)基因表達(dá)水平均無(wú)顯著差異,說(shuō)明PARG1調(diào)控?cái)M南芥對(duì)B.cinerea抗病性不是通過(guò)調(diào)控PRs基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　 考慮到活性氧和細(xì)胞死亡在B.cinerea侵染植物過(guò)程中的作用,以B.cinerea接種擬南芥,分析野生型、parg1和PARG1-OE株系的活性氧產(chǎn)生和細(xì)胞死亡狀況。發(fā)現(xiàn)parg1突變體葉片中積累的活性氧含

7、量比野生型葉片積累的活性氧含量少,而野生型葉片中活性氧的積累比PARG1-OE株系葉片中積累得少;同時(shí)發(fā)現(xiàn)在B.Cinerea發(fā)病過(guò)程中,parg1植株葉片細(xì)胞的死亡數(shù)量比野生型葉片細(xì)胞的死亡數(shù)量少。為了進(jìn)一步研究PARG1基因在細(xì)胞死亡中的功能,分別對(duì)擬南芥各株系接種Pst DC3000(avr RPM1)和高濃度Pst DC3000,PARG1-OE株系葉片細(xì)胞均比野生型葉片細(xì)胞易于死亡,而野生型葉片細(xì)胞均比parg1突變體葉片細(xì)胞

8、易于死亡,說(shuō)明PARG1參與過(guò)敏性細(xì)胞死亡的調(diào)控?？紤]到聚ADP-核酸[poly(ADP-ribose),PAR]作為死亡信號(hào)的作用,應(yīng)用PAR處理野生型、parg1突變體和PARG1-OE株系,發(fā)現(xiàn)PAR能誘導(dǎo)parg1突變體細(xì)胞凋亡,但并不引發(fā)細(xì)胞壞死,而caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO能部分抑制PAR引發(fā)的細(xì)胞凋亡,表明受PARG1調(diào)控的胞內(nèi)PAR能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其凋亡途徑部分依賴caspase凋亡途徑。
　　

9、 本文還比較分析了parg1-3突變體和轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)株系對(duì)干旱等非生物逆境的表型差異?；虮磉_(dá)結(jié)果表明,干旱和氧化脅迫處理,野生型擬南芥中的PARG1基因上調(diào)表達(dá)。在含甘露醇和甲基紫腈(methyl viologen,MV)的培養(yǎng)基中進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn),模擬干旱和氧化脅迫逆境,發(fā)現(xiàn)parg1-3種子的發(fā)芽率比野生型種子發(fā)芽率降低,但以脫落酸(absisic acid,ABA)處理進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn),兩者種子表現(xiàn)出相似的發(fā)芽率。在干旱、滲透和

10、氧化脅迫下,parg1-3植株比野生型植株表現(xiàn)出較弱的忍耐力。在干旱逆境下,野生型植株葉片的氣孔完全閉合,而parg1-3植株葉片的氣孔不能完全閉合;但在ABA處理下,parg1-3植株葉片與野生型植株葉片的氣孔閉合狀況相似。此外,在干旱逆境中,parg1-3植株與野生型植株的干旱逆境/ABA反應(yīng)基因表達(dá)水平相似。而在氧化脅迫下,parg1-3植株中的氧化脅迫相關(guān)基因,如交替氧化酶1(alternative oxidase1,Aox1)

11、和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase2,Apx2)下調(diào)表達(dá)。不論是干旱、滲透、氧化脅迫處理,還是ABA處理,PARG1的轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)株系均未表現(xiàn)出與野生型植株的差異。這些結(jié)果表明,PARG1基因在擬南芥對(duì)多種類(lèi)型的逆境反應(yīng)中起重要作用。
　　 上述結(jié)果表明,PARG1基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的PAR含量,維持細(xì)胞內(nèi)NAD+和ATP含量,在植物抗病和抗逆反應(yīng)中起重要作用。研究結(jié)果對(duì)全面認(rèn)識(shí)和理解擬南芥在抗