O型FMDV VP1基因與山羊IL-18基因在昆蟲細(xì)胞中的共表達(dá)與活性檢測(cè).pdf

1、口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是危害牛、豬、羊等偶蹄動(dòng)物以及人的一種烈性傳染病,被國(guó)際獸疫局(OIE)列為A類疾病。目前預(yù)防FMD的最有效措施是接種疫苗,結(jié)構(gòu)蛋白VP1是FMDV最主要的抗原,能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗FMDV的中和抗體,在口蹄疫免疫預(yù)防的研究中倍受關(guān)注,對(duì)口蹄疫基因工程疫苗的研制具有重要的意義。白細(xì)胞介素18(Interleukin-18,IL-18)具有多種生物學(xué)活性,在免疫調(diào)節(jié)、抗感染及慢性

2、炎癥性疾病發(fā)病過程中起著重要作用。因此,IL-18可作為免疫佐劑與一些病原微生物的保護(hù)性基因共表達(dá),從而加強(qiáng)和改善疫苗的免疫效果。鑒于此,本實(shí)驗(yàn)室對(duì)山羊白介素18(goat interleukin-18,gIL-18)成熟蛋白基因與VP1基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中進(jìn)行了共表達(dá),旨在探索gIL-18對(duì)口蹄疫的免疫調(diào)節(jié)作用,為研制有效的口蹄疫疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的序列,設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,分別以pMD18-T-

3、VP1和pET32a-gIL18質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增山羊白細(xì)胞介素18成熟蛋白cDNA基因序列及O型口蹄疫病毒VP1基因序列。再以桿狀病毒pFastBacTMDual為載體,將VP1基因和gIL-18基因分別插入到雙表達(dá)載體的P10啟動(dòng)子和多角體蛋白啟動(dòng)子PH的下游,構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFastBacTMDual-gIL-18-VP1。然后轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)三重抗性(含卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素)與藍(lán)白斑篩選,用小量法提取桿

4、狀病毒重組質(zhì)粒DNA,在此基礎(chǔ)上通過一對(duì)通用引物M13(該引物擴(kuò)增重組質(zhì)粒BacmidLacZα區(qū)域內(nèi)的mini-attTn7位點(diǎn)兩端的片段,任何外源性基因片段插入pFastBacTM dual質(zhì)粒內(nèi)都會(huì)使PCR產(chǎn)物增大)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,鑒定pFastBacTM dual-gIL18-VP1質(zhì)?？寺〉綏U狀病毒表達(dá)載體,獲得桿狀病毒重組質(zhì)粒 Bacmid-gIL18-VP1。在轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin的作用下,將Bacmid-gIL1

5、8-VP1轉(zhuǎn)染至草地貪夜蛾細(xì)胞(Spodoptera frugiperda9,sf9)獲得重組桿狀病毒,然后將重組桿狀病毒感染sf9,感染后不同時(shí)間收獲sf9細(xì)胞及培養(yǎng)上清,進(jìn)行SDS-PAGE電泳、Western blot和間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè),分析表達(dá)情況并對(duì)共表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)活性分析。結(jié)果表明,用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建了同時(shí)含有g(shù)IL-18成熟蛋白基因和O型口蹄疫病毒VP1基因的重組桿狀病毒,兩者均在昆蟲細(xì)胞的裂