甜菜夜蛾cDNA文庫的構建及幾丁質合成酶基因片段的克隆.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、幾丁質是昆蟲表皮(外骨骼)的主要成分，也是許多昆蟲腸道表皮的重要成分，在昆蟲中起到肌肉著生點、保護內臟器官和防止水分蒸發(fā)的作用，并且可以防止有害物質的入侵。幾丁質合成酶(CHS)介導幾丁質的合成。由于CHS表達的不穩(wěn)定性，迄今只有黑腹果蠅、煙草天蛾、岡比亞按蚊等七種昆蟲的CHS全長基因得到了克隆?！　嫿╟DNA文庫不但可以快速、高效地克隆未知基因，而且有利于進一步研究基因功能。本實驗以甜菜夜蛾5齡幼蟲為材料，采用Invitrogen

2、公司FastTrack(R)2.0KitforisolationofmRNAs試劑盒一步法直接提取mRNA，經紫外分光光度計檢測OD260/OD280=2，質量為10.24μg，說明提取的mRNA不論從純度還是含量都可以很好地滿足實驗要求。采用Stratagene公司的ZAPExpress(R)cDNASynthesisKit以及ZAPExpress(R)cDNAGigapack(R)ⅢGoldCloningKit構建了甜菜夜蛾cDNA

3、表達文庫。將合成的雙鏈cDNA通過SepharoseCL-2B去除400bp以下的小片段，有效地保證了文庫中所包含的長序列的豐度。經檢測文庫的初始滴度為1.1×105pfu/ml，重組率為97％，擴增后文庫的滴度為5.4×107pfu/ml，完全符合cDNA文庫的要求。　　以文庫為模板克隆幾丁質合成酶Ⅰ的部分序列(988bp)，與本實驗已獲得的幾丁質合成酶基因進行序列拼接，得到5207bp的序列，其開放讀碼框長4698bp。經序列分析

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