甜菜夜蛾cDNA文庫的構(gòu)建及幾丁質(zhì)合成酶基因片段的克隆.pdf

1、幾丁質(zhì)是昆蟲表皮(外骨骼)的主要成分，也是許多昆蟲腸道表皮的重要成分，在昆蟲中起到肌肉著生點(diǎn)、保護(hù)內(nèi)臟器官和防止水分蒸發(fā)的作用，并且可以防止有害物質(zhì)的入侵。幾丁質(zhì)合成酶(CHS)介導(dǎo)幾丁質(zhì)的合成。由于CHS表達(dá)的不穩(wěn)定性，迄今只有黑腹果蠅、煙草天蛾、岡比亞按蚊等七種昆蟲的CHS全長基因得到了克隆?！　?gòu)建cDNA文庫不但可以快速、高效地克隆未知基因，而且有利于進(jìn)一步研究基因功能。本實(shí)驗(yàn)以甜菜夜蛾5齡幼蟲為材料，采用Invitrogen

2、公司FastTrack(R)2.0KitforisolationofmRNAs試劑盒一步法直接提取mRNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測OD260/OD280=2，質(zhì)量為10.24μg，說明提取的mRNA不論從純度還是含量都可以很好地滿足實(shí)驗(yàn)要求。采用Stratagene公司的ZAPExpress(R)cDNASynthesisKit以及ZAPExpress(R)cDNAGigapack(R)ⅢGoldCloningKit構(gòu)建了甜菜夜蛾cDNA

3、表達(dá)文庫。將合成的雙鏈cDNA通過SepharoseCL-2B去除400bp以下的小片段，有效地保證了文庫中所包含的長序列的豐度。經(jīng)檢測文庫的初始滴度為1.1×105pfu/ml，重組率為97％，擴(kuò)增后文庫的滴度為5.4×107pfu/ml，完全符合cDNA文庫的要求。　　以文庫為模板克隆幾丁質(zhì)合成酶Ⅰ的部分序列(988bp)，與本實(shí)驗(yàn)已獲得的幾丁質(zhì)合成酶基因進(jìn)行序列拼接，得到5207bp的序列，其開放讀碼框長4698bp。經(jīng)序列分析