絨山羊皮膚干細(xì)胞定位、遷移及次級(jí)毛囊生長(zhǎng)期差異表達(dá)基因文庫(kù)的構(gòu)建與篩選.pdf

1、本論文旨在研究絨山羊皮膚干細(xì)胞的分布位置及遷移軌跡，構(gòu)建生長(zhǎng)期和休止期次級(jí)毛囊差異表達(dá)基因文庫(kù)，篩選與絨山羊次級(jí)毛囊生長(zhǎng)相關(guān)的特異表達(dá)基因，從而揭示產(chǎn)絨動(dòng)物不同類(lèi)型的毛囊干細(xì)胞的行為特征、定位分布、相互關(guān)系，特別是尚未見(jiàn)報(bào)道的次級(jí)毛囊的干細(xì)胞生物學(xué)特性，為建立毛囊干細(xì)胞休眠、增殖、遷移、分化和決定等生命活動(dòng)過(guò)程和機(jī)制的模式提供方法和理論依據(jù)。 選擇體態(tài)相近、健康的周歲絨山羊，分成兩組：標(biāo)記BrdU的實(shí)驗(yàn)組和未標(biāo)記BrdU的對(duì)照組

2、。根據(jù)干細(xì)胞的慢周期特性，對(duì)絨山羊表皮細(xì)胞DNA進(jìn)行BrdU標(biāo)記，定期取背部皮樣，4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，免疫組化檢測(cè)，結(jié)果前10周內(nèi)BrdU結(jié)果呈陽(yáng)性。8周，BrdU標(biāo)記細(xì)胞主要位于初級(jí)、次級(jí)毛囊的毛球部，毛干也有分布；8～10周，BrdU標(biāo)記細(xì)胞僅位于初、次級(jí)毛囊的外根鞘；10周后無(wú)陽(yáng)性信號(hào)分布。選擇BrdU標(biāo)記8周和8～10周的絨山羊背部皮樣，分離酶Ⅱ4℃消化3小時(shí)，分離完整毛囊。分別用分段培養(yǎng)法和Ⅳ型膠原粘附法對(duì)毛囊

3、標(biāo)記細(xì)胞（毛球部和毛囊中段）進(jìn)行培養(yǎng)，能形成典型的干細(xì)胞克隆，且細(xì)胞直徑較小，核質(zhì)比較大，符合皮膚干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。用皮膚干細(xì)胞的標(biāo)志分子P63對(duì)BrdU標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定，發(fā)現(xiàn)BrdU標(biāo)記滯留細(xì)胞呈陽(yáng)性。以上結(jié)果證明BrdU標(biāo)記滯留細(xì)胞即為皮膚干細(xì)胞，初步確定干細(xì)胞位于初級(jí)、次級(jí)毛囊的毛母質(zhì)和外根鞘，在表皮基底層也有分布。 為進(jìn)一步闡明次級(jí)毛囊周期性重建過(guò)程中干細(xì)胞分化啟動(dòng)—休眠的調(diào)控基因，以生長(zhǎng)期和休止期次級(jí)毛囊為研

4、究對(duì)象，利用抑制性消減雜交技術(shù)，構(gòu)建了具有高消減效率的生長(zhǎng)和休止期次級(jí)毛囊的cDNA文庫(kù)。挑取20個(gè)陽(yáng)性克隆，用NestedPCRPrimer1和2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，插入片段長(zhǎng)度主要分布在250～1000bp之間。 隨機(jī)挑取正、反向兩個(gè)差異表達(dá)基因文庫(kù)中的單克隆各750個(gè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，分別獲得309條和344條有效序列，平均長(zhǎng)度分別為693bp和596bp。將其進(jìn)行同源性分析，各獲得224個(gè)和300個(gè)nucleotide

5、數(shù)據(jù)庫(kù)中山羊及其他物種的已知存在序列同源。在EST數(shù)據(jù)庫(kù)中分別找到76個(gè)、38個(gè)相似EST序列，還有9個(gè)和6個(gè)無(wú)同源性序列。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)共注冊(cè)非冗余ESTs126條，序列號(hào)為64970025～64970150。對(duì)已知功能基因的ESTs進(jìn)行分類(lèi)，正反庫(kù)中細(xì)胞分裂類(lèi)各為15個(gè)和13個(gè)、細(xì)胞信號(hào)類(lèi)為44個(gè)和49個(gè)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白30個(gè)和52個(gè)、細(xì)胞防御類(lèi)13個(gè)和21個(gè)、代謝類(lèi)24個(gè)和46個(gè)、基因/蛋白表達(dá)類(lèi)33個(gè)和37個(gè)、未分類(lèi)的65

6、個(gè)和82個(gè)。 在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了兩次熒光交換的cDNA芯片雜交，以篩選差異表達(dá)基因。發(fā)現(xiàn)6個(gè)次級(jí)毛囊生長(zhǎng)期的差異基因，其中上調(diào)基因3個(gè)，下調(diào)基因3個(gè)；10個(gè)次級(jí)毛囊休止期的差異基因，其中上調(diào)基因9個(gè)，下調(diào)基因1個(gè)。 總之，本研究首次用BrdU活體標(biāo)記追蹤的方法證明絨山羊初級(jí)、次級(jí)毛囊及表皮中均存在皮膚干細(xì)胞：首次建立了用SSH方法分離絨山羊次級(jí)毛囊生長(zhǎng)和休止期差異表達(dá)基因的方法，并結(jié)合熒光交換的cDNA芯片雜交來(lái)篩選。所