柞蠶滯育關(guān)聯(lián)蛋白2的表達(dá)與分子特性的研究.pdf

1、昆蟲(chóng)滯育關(guān)聯(lián)蛋白(DAP)是在研究昆蟲(chóng)滯育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)與昆蟲(chóng)滯育的發(fā)生和維持有關(guān)的蛋白。目前為止，關(guān)于昆蟲(chóng)DAP的研究甚少，對(duì)其分子特性及其如何參與滯育過(guò)程尚不清楚。
　　本研究從NCBI獲取柞蠶滯育關(guān)聯(lián)蛋白基因2（diapause-associatedprotein2，dap2）的序列，GenBank登錄號(hào)為JQ003184.1。比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，DAP2與煙草天蛾和家蠶眼色素結(jié)合蛋白(OBP)同源性可達(dá)到56％和57％，推測(cè)其

2、可能是一種OBP。信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，DAP2可能有信號(hào)肽，為分泌型蛋白，這與其攜帶和轉(zhuǎn)運(yùn)色素功能相符。蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)其內(nèi)部可能形成一個(gè)眼色素結(jié)合位點(diǎn)。
　　液氮研磨柞蠶蛹脂肪體組織，利用TRIzolReagent提取RNA，利用RT-PCR擴(kuò)增得到dap2基因片段（去掉預(yù)測(cè)信號(hào)肽的序列）的并克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a(+)-dap2，在E.coliBL21(DE3)誘

3、導(dǎo)表達(dá)重組DAP2。經(jīng)SDS-PAGE分析有一大小30kD特異性蛋白條帶表達(dá)，與預(yù)期值相符，經(jīng)質(zhì)譜鑒定正確。進(jìn)一步利用鎳柱親和層析純化該蛋白，并免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，Westernblot檢測(cè)抗體特異性較高。
　　繼而利用熒光定量PCR及Westernblot檢測(cè)柞蠶各發(fā)育時(shí)期及各組織的dap2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況。結(jié)果表明，滯育期dap2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平最高，其次是在非滯育蛹期和五齡幼蟲(chóng)中，這與DAP與滯育過(guò)程相關(guān)

4、相吻合。五齡幼蟲(chóng)脂肪體中dap2基因的轉(zhuǎn)錄水平最高，血淋巴中DAP2表達(dá)水平最高，這提示DAP2可能在脂肪體中合成后分泌到血淋巴中。
　　為了進(jìn)一步闡明DAP2的分子特性，本研究從非滯育蛹血淋巴中分離純化到純度約94％的DAP2蛋白。全波長(zhǎng)掃描測(cè)定發(fā)現(xiàn)其在可見(jiàn)光范圍內(nèi)不存在特異的吸收峰，PNGaseF特異性地切割N-糖鏈，DAP2分子量減少2kD左右，表明該蛋白為糖蛋白。雙向電泳并結(jié)合質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明純化后的蛋白存在三個(gè)不同的點(diǎn)，