家蠶和柞蠶Karyopherin蛋白家族的分子克隆與功能研究.pdf

1、核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Karyopherin，又稱為Importin，包括alpha型和beta型，是真核生物細(xì)胞進(jìn)行核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的重要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以攜帶貨物蛋白通過核孔復(fù)合物入核或出核。alpha型Karyopherin（KPNA）自身不能單獨(dú)攜帶貨物蛋白通過核孔復(fù)合物入核，而是作為接頭蛋白將貨物蛋白和Karyopherin beta1連接起來形成三聚復(fù)合體，此三聚復(fù)合物才能通過核孔復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核。beta型Karyopherin（KPNB）具有

2、多種類型，包括Importin beta，Exportin和Transportin。Improtin beta從事入核運(yùn)輸，其中只有Karyopherin beta1（KPNB1）可與KPNA及貨物蛋白形成三聚復(fù)合體；Exportin從事出核運(yùn)輸；Transportin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核質(zhì)之間進(jìn)行雙向運(yùn)輸。
　　通過檢索家蠶基因組數(shù)據(jù)庫（SilkDB），發(fā)現(xiàn)了三條預(yù)測(cè)的KPNA基因和一條預(yù)測(cè)的KPNB基因。我們?cè)O(shè)計(jì)引物在家蠶和柞蠶中

3、成功克隆了這四條基因的cDNA。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)家蠶和柞蠶的KPNA的開放閱讀框（ORF）的長(zhǎng)度分別為1563 bp、1515bp和1551 bp，分別編碼520AA、504AA、516AA的蛋白。家蠶和柞蠶的KPNA ORF和蛋白的相似度分別為99.55％/100%、99.93%/100%和99.68%/99.50%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹后發(fā)現(xiàn)家蠶和柞蠶的這三條KPNA分別屬于α1，α2和α3三個(gè)亞族，除了果蠅外其它昆蟲至多有三條分屬于三個(gè)不同亞

4、族的KPNA基因，因此將家蠶和柞蠶三種KPNA依它們所屬的亞族命名為KPNA1、KPNA2和KPNA3。家蠶和柞蠶KPNB ORF分別為2661 bp和2658 bp，分別編碼886AA和885AA，ORF與蛋白的相似度為80.16%與91.12%。通過序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)此KPNB與其它物種KPNB1歸為一個(gè)亞類，因此我們命名此KPNB為KPNB1。
　　將家蠶和柞蠶的KPNA1、2、3和KPNB1的ORF構(gòu)建入pET-

5、28a（+）質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)，均可以表達(dá)出與這些蛋白預(yù)測(cè)的分子量相符合的重組蛋白。對(duì)家蠶和柞蠶KPNA1、2、3和 KPNB1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析，KPNA1、2、3都有一個(gè) IBB（ importin beta binding domain）結(jié)構(gòu)域和8、4、7個(gè)典型的 ARM重復(fù)（armadillo/beta-catenin-like repeats）；家蠶和柞蠶KPNB1有19個(gè)典型的HEAT重復(fù)（ Huntingtin, E

6、longation factor3, protein phosphatase2A and TOR1 repeats），構(gòu)成了IBB_N和IBB-binding domain。疏水性分析表明家蠶和柞蠶KPNA的N端的約100AA為親水結(jié)構(gòu)域，對(duì)應(yīng)于IBB結(jié)構(gòu)域。KPNA同源建模結(jié)果也表明IBB結(jié)構(gòu)域游離于主體結(jié)構(gòu)外。KPNA的C端和KPNB1是親水和疏水相間隔，同源建模結(jié)果表明，他們都擁有十?dāng)?shù)個(gè)α螺旋的巢式結(jié)構(gòu)。GST pull-down

7、結(jié)果證實(shí)KPNB1能與KPNA的IBB結(jié)構(gòu)域在體外相互作用，而去除了IBB的KPNA則不能在體外于KPNB1相互作用。
　　我們檢測(cè)了KPNA和KPNB1 mRNA在家蠶和柞蠶5齡3天幼蟲各組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KPNA和KPNB1在所有組織類型都表達(dá)。KPNA和KPNB1在不同組織的表達(dá)水平存在著顯著差異。家蠶KPNA1表達(dá)水平在表皮中最高，其次為馬氏管、血細(xì)胞和中腸，脂肪體和絲腺表達(dá)水平低；家蠶KPNA2在血細(xì)胞中表達(dá)量最

8、高，其余五個(gè)組織中低；家蠶KPNA3和KPNB1在血細(xì)胞、馬氏管和中腸組織中表達(dá)量高，在其余三個(gè)組織中表達(dá)量低。柞蠶在馬氏管、血細(xì)胞和中腸表達(dá)量高，在表皮、脂肪體和絲腺中表達(dá)量低；KPNA2脂肪體中表達(dá)量高，在其余五個(gè)組織中的表達(dá)量低；KPNA3在血細(xì)胞、脂肪體和絲腺組織中表達(dá)量高，在馬氏管、中腸和表皮的表達(dá)量低；KPNB1在血細(xì)胞、馬氏管和絲腺組織中表達(dá)量高，在其余三個(gè)組織中表達(dá)量低。
　　為了弄清家蠶和柞蠶KPNA和KPNB1

9、在自然免疫反應(yīng)中表達(dá)變化，我們用革蘭氏陽性菌（藤黃微球菌或枯菌桿菌）、革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)、病毒（核型多角體病毒）或真菌（白僵菌）分別對(duì)家蠶和柞蠶5齡3天幼蟲進(jìn)行免疫刺激，然后分析KPNA和KPNB1 mRNA在脂肪體和血細(xì)胞中的表達(dá)變化。
　　家蠶脂肪體的KPNA mRNA表達(dá)水平一般是在1和8小時(shí)下調(diào)而在4和12小時(shí)上調(diào)；KPNA1對(duì)大腸桿菌、白僵菌和核型多角體病毒的侵染較為敏感；KPNA3對(duì)藤黃微球菌、大腸桿菌和白僵菌較

10、為敏感；而KPNA2對(duì)上述四種微生物的侵染較不敏感；KPNB1在大腸桿菌、藤黃微球菌侵染的1、4或8小時(shí)沒有明顯的變化，但在12小時(shí)分別增加到2.97倍和4.93倍，在應(yīng)對(duì)白僵菌和核型多角體病毒侵染時(shí)只是輕微上下波動(dòng)。
　　家蠶血細(xì)胞的KPNA和KPNB1的mRNA水平先是下調(diào)再上調(diào)。在4小時(shí)mRNA表達(dá)水平降至最低。它們?cè)趹?yīng)對(duì)白僵菌侵染時(shí)最為敏感，在8小時(shí)mRNA表達(dá)水平分別上升到15.54、19.32、8.09和3.93倍。<

11、br>　　柞蠶脂肪體KPNA1和KPNB1的mRNA表達(dá)水平均下調(diào)；KPNA2在枯草桿菌處理的12和48小時(shí)分別上調(diào)了10.4和7.2倍，在大腸桿菌處理的0.5和48小時(shí)上調(diào)至9.8
　　倍和84.2倍，在核型多角體病毒處理的3和6小時(shí)上調(diào)了6.1和38.4倍，在白僵菌處理的0.5、3和6小時(shí)上調(diào)了23.3、11.2和22.2倍；KPNA3在枯草桿菌處理的0.5、3、12和48小時(shí)分別上調(diào)了9.8、6.4、5.7和13.8倍，在大

12、腸桿菌處理的0.5和48小時(shí)上調(diào)了45.7倍和96.1倍，在核型多角體病毒處理的6小時(shí)上調(diào)至69.23倍，在白僵菌處理的3和6小時(shí)上調(diào)至10.4和80.3倍。
　　柞蠶血細(xì)胞的KPNA和KPNB1在枯草桿菌處理的24小時(shí)分別上調(diào)至15.9、39.9、2.17和2.77倍，而其它時(shí)間點(diǎn)下調(diào)。大腸桿菌處理組中四種蛋白mRNA水平在0.5小時(shí)分別上調(diào)至3.8、10.1、5.5和20.3倍；除了KPNA3外的其余三個(gè)蛋白mRNA在24小時(shí)

13、上調(diào)至21.9、23.1和3.7倍，在48小時(shí)上調(diào)至9.7、10.8和5.7倍。KPNA3在核型多角體處理的6小時(shí)mRNA表達(dá)水平上調(diào)至12.4倍，而KPNA2在3小時(shí)和24小時(shí)上調(diào)至2.0和2.3倍。白僵菌處理組中KPNB1 mRNA始終在低水平表達(dá)，KPNA1的mRNA表達(dá)水平在3小時(shí)和24小時(shí)分別上調(diào)至13.5和13.7倍；KPNA2在3小時(shí)和24小時(shí)分別上調(diào)至132.5和5.6倍；而KPNA3在3小時(shí)上調(diào)了41.1倍。
　

14、　KPNA的體外pull-down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能的KPNA3的貨物蛋白：熱體克轉(zhuǎn)錄因子（HSF）。45°C熱激30分鐘的雄性家蠶蛹在熱激后4小時(shí)和24小時(shí)各出現(xiàn)了熱休克蛋白HSP19.9、HSP20.4和HSP25.4的mRNA表達(dá)峰。用RNA干擾技術(shù)分別 knock down KPNA3和HSF皆可以消除家蠶蛹熱應(yīng)激后24小時(shí)的HSP表達(dá)峰，表明KPNA3是家蠶HSF的入核轉(zhuǎn)運(yùn)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。GST pull-down實(shí)驗(yàn)也在體外驗(yàn)證