煙草堿性β-1,3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化‘DoubleMariachiPink’洋桔梗的研究.pdf

1、洋桔梗（Eustoma grandiflorum）屬龍膽科一、二年生的草本觀賞植物，原產(chǎn)于美洲中部地區(qū)。它具有色彩豐富、花朵美麗等特點(diǎn)，作為切花新秀，越來越受到人們的喜愛，是近年來世界上十分流行的十大切花之一。
　　 然而，洋桔梗在栽培中很容易受真菌的侵害，由真菌引起的病害占其總病害的80％。本研究以洋桔?！瓺ouble Mariachi Pink'品種為試驗(yàn)材料，將煙草抗真菌的β-1,3-葡聚糖酶基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入其中

2、，以期培育出抗真菌的洋桔梗新種質(zhì)。
　　 首先，以煙草基因組DNA為模板，根據(jù)煙草‘Samsun'抗真菌的堿性β-1,3-葡聚糖酶基因序列設(shè)計引物，利用PCR方法擴(kuò)增出特異的目的基因，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。該序列（GenBank 登錄號：EU867448）全長1868bp，包含2個外顯子和1個內(nèi)含子；除終止密碼子外，共編碼359個氨基酸。該酶分子量為28.4kD，pI為9.72，是一個堿性蛋白。該酶蛋白與顛茄、馬鈴薯等茄科

3、植物的β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列同源性分別達(dá)到89％和81％。
　　 然后，將該基因回收克隆，與pBI121重組，成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-glu，并將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404；再利用本實(shí)驗(yàn)室已優(yōu)化的洋桔梗葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化洋桔梗‘Double Mariachi Pink'品種。
　　 最后，對洋桔梗的卡那霉素抗性再生植株進(jìn)行檢測。32個再生株系的抗性苗經(jīng)生根篩選，有17個株系生根，生