耐鹽多基因?qū)帡?號體內(nèi)遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、楊樹(Populus)是世界中緯度地區(qū)廣泛栽培的主要造林樹種之一，具有速生優(yōu)勢，適應性強，繁殖容易等特點，受到包括中國在內(nèi)的許多國家的歡迎。隨著楊樹人工林面積的不斷擴大，土壤鹽漬化問題越來越突出，危害嚴重，利用基因工程技術(shù)培育耐鹽堿楊樹新樹種，是提高鹽漬化土地利用率的有效手段。本研究將MA(SOS1-SOS2-SOS3-CBL10-Bar)、MB(SOS1-SOS2-SOS3-CBL10-P19-Bar)多基因表達載體分別轉(zhuǎn)入寧楊1號，

2、獲得了轉(zhuǎn)多基因植株，并進行了初步鑒定。轉(zhuǎn)多基因植株的獲得為探討抗性轉(zhuǎn)多基因楊樹的實際應用奠定了良好的基礎。主要實驗結(jié)果如下：
　　 1.寧楊1號高頻再生體系的優(yōu)化
　　 以毛白楊優(yōu)良品種寧楊1號為受體，優(yōu)化了寧楊1號葉片分化體系。篩選出寧楊1號葉片外植體不定芽直接分化的最適分化培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L6-BA+0.2mg/L NAA。篩選出最適生根培養(yǎng)基：1/2MS+0.3mg/LNAA。確定了抑菌劑、篩選劑的濃度

3、：最適抑菌劑為Cef濃度為600mg/L；最適除草劑篩選濃度為0.8mg/L PPT。
　　 2.寧楊1號多基因遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化
　　 將預先培養(yǎng)的含有MA、MB多基因表達載體的農(nóng)桿菌菌液分別用含有5％蔗糖的MS溶液稀釋菌液至OD600值為0.4～0.6，侵染帶有傷口的幼嫩葉片組織10 min，共培養(yǎng)2d后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+0.8mg/LPPT+600mg/LCef

4、)進行抗性篩選培養(yǎng)。30d后分別獲得轉(zhuǎn)MA、MB多基因表達載體的抗性植株76株、58株。
　　 3.轉(zhuǎn)多基因抗性植株的PCR檢測
　　 以獲得的抗性植株的基因組為模板，利用MA、MB內(nèi)各功能基因的特異引物，分別進行PCR檢測，檢測結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)MA多基因表達載體的抗性植株中有10株，擴增出了目的條帶；轉(zhuǎn)MB多基因表達載體的抗性植株中有6株擴增出了目的條帶。初步證明目的基因已經(jīng)整合到寧楊1號基因組中。
　　 4.Ba

5、r基因的功能驗證
　　 將PCR檢測出的陽性株系與野生型對照植株分別轉(zhuǎn)入含有2mg/LPPT的生根培養(yǎng)基(1/2MS+0.3mg/LNAA+2mg/LPPT)中培養(yǎng)，兩周后觀察各株系對PPT的敏感程度。實驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)多基因株系能夠在含有2mg/LPPT的生根培養(yǎng)基中正常生長，而野生型對照植株干枯死亡，表明Bar基因已在轉(zhuǎn)多基因株系中表達。進一步證明外源目的基因已經(jīng)整合到寧楊1號基因組中。
　　 5.轉(zhuǎn)多基因?qū)帡?號植株