1型鴨疫里默氏桿菌比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究及抗體檢測(cè)方法的建立.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)是一種革蘭氏陰性菌，火雞、水禽等對(duì)其敏感。它是鴨疫里默氏桿菌病的病原體，主要引起宿主的纖維素性氣囊炎、腦膜炎、心包炎、肝周炎、以及干酪性輸卵管炎，并伴有不同程度的敗血癥，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展存在著巨大的威脅。因此，開(kāi)發(fā)鴨疫里默氏桿菌病的疫苗對(duì)防止該疫病的發(fā)生有重大意義。同時(shí)，建立一種診斷鴨疫里默氏桿菌抗體的方法也對(duì)臨床實(shí)踐中監(jiān)測(cè)免疫效果、診斷疾病具有指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)中對(duì)限

2、鐵環(huán)境中的RA以及正常培養(yǎng)環(huán)境中的RA的分泌蛋白進(jìn)行差異比較，發(fā)現(xiàn)其差異表達(dá)的蛋白，并對(duì)差異蛋白的免疫原性進(jìn)行鑒定。此外，利用重組ompA蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)RA抗體的間接ELISA方法，主要完成以下研究工作：
　　 通過(guò)模擬動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的限鐵環(huán)境，在限鐵環(huán)境中培養(yǎng)RA。通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)，利用雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜鑒定技術(shù)，鑒定出在限鐵環(huán)境中有23個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)量上升，選取其中的12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，分別代表了8類(lèi)蛋白

3、質(zhì)，包括Ⅲ型纖維連接蛋白、分泌蛋白家族蛋白、磷酸甘油酸酯激酶、亮氨酸富集蛋白質(zhì)、2類(lèi)RA假想蛋白、似半乳糖結(jié)合區(qū)域蛋白、延伸因子。
　　 選取理論等電點(diǎn)、分子量和實(shí)際等電點(diǎn)、分子量相近的蛋白質(zhì)Fe10和Fe19(hypothetical protein Riean_1750和hypothetical protein Riean_1752)進(jìn)行原核表達(dá)。構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Fe10和pET-28a(+)-Fe19，

4、并通過(guò)蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)技術(shù)，表達(dá)出Fe10和Fe19蛋白。經(jīng)過(guò)鎳親和層析純化，獲得了較高純度的RA的Fe10和Fe19兩種蛋白。
　　 通過(guò)Western-blotting分析，表明蛋白質(zhì)Fe10和Fe19與RA的陽(yáng)性血清是有反應(yīng)性的。通過(guò)鴨的免疫攻毒試驗(yàn)，證明蛋白質(zhì)Fe10和Fe19對(duì)鴨具有一定的免疫保護(hù)性。且兩種蛋白同時(shí)配合免疫，比單獨(dú)一種蛋白作為免疫原具有更好的免疫保護(hù)力。
　　 此外，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28

5、a(+)-ompA，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)后，表達(dá)出RA的ompA蛋白。經(jīng)過(guò)純化的重組ompA蛋白作為包被物，以方陣滴定法確定抗原包被濃度為1.5μg/mL，待檢血清稀釋度為1:100。
　　 與普通的微量凝集試驗(yàn)相比，該方法靈敏度較高，比凝集試驗(yàn)高16-128倍。與鴨源大腸桿菌、多殺巴氏桿菌、鏈球菌、呼腸孤病毒、鴨肝炎病毒和鴨瘟病毒感染鴨血清均無(wú)交叉反應(yīng)，表明該方法特異性強(qiáng)。ompA蛋白作為抗原包被到酶標(biāo)板之后于-20℃保存時(shí)間為3個(gè)月