鴨疫里默氏桿菌雙重PCR方法的建立及50S L27轉(zhuǎn)座子插入突變株的部分生物學(xué)特性分析.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌感染（Riemerella anatipestifer infection）是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要疾病之一，主要感染鴨、鵝等多種禽類的接觸性傳染疾病，又稱為鴨傳染性漿膜炎。該病是由黃桿菌科里默氏桿菌屬的鴨疫里默氏桿菌引起的，感染鴨會出現(xiàn)生長緩慢，消瘦，飼料轉(zhuǎn)化率降低，肉品質(zhì)下降，及高死亡率等癥狀，在養(yǎng)殖和疾病的治療等方面給我國養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。
　　目前確認的鴨疫里默氏桿菌的血清型至少有21個，公布在GenB

2、ank上的就有9株鴨疫里默氏桿菌的全基因序列。鴨疫里默氏桿菌的編碼基因超過2000個，而目前已研究的只有其中的極少數(shù)?，F(xiàn)階段控制鴨疫里默氏桿菌病的主要方法是注射疫苗和抗菌性藥物，而絕大部分鴨疫里默氏桿菌菌株對卡那霉素有抗藥性，因此本研究通過構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌的轉(zhuǎn)座子隨機突變庫，來篩選和鑒定鴨疫里默氏桿菌對卡那霉素耐藥相關(guān)的基因。
　　試驗一是根據(jù)鴨疫里默氏桿菌CH3株dnaB基因和16S rRNA的序列設(shè)計引物，構(gòu)建了雙重PCR檢

3、測方法。采用方陣法對雙重PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行優(yōu)化改造，優(yōu)化的反應(yīng)退火溫度為60℃。試驗結(jié)果表明，該新型雙重PCR技術(shù)能準確檢驗鴨疫里默氏桿菌，對檢測的所有不同血清型鴨疫里默氏桿菌菌株均能擴增出364 bp和627 bp兩條特異的目的片段，而對鴨致病性大腸桿菌、鴨源禽巴氏桿菌、腸炎沙門氏菌、黃桿菌等對照菌株的擴增結(jié)果均為陰性；該PCR方法對細菌HXb2基因組DNA和菌液的檢測敏感性分別為17.33 ng/mL DNA和2.9×10

4、3 CFU/mL細菌。利用建立的雙重PCR檢測了鴨疫里默氏桿菌感染鴨的肝臟和腦組織中的鴨疫里默氏桿菌，結(jié)果顯示該方法與細菌分離法符合率分別為100％（9/9）和77.8%(7/9)，表明本試驗建立的雙重PCR方法可用于檢測肝臟組織中鴨疫里默氏桿菌。本研究建立的雙重PCR方法既可以對分離的鴨疫里默氏桿菌疑似菌株進行快速檢測和鑒定，也可以直接用于臨床樣品中鴨疫里默氏桿菌的檢測。
　　試驗二是鴨疫里默氏桿菌分離株的卡那霉素藥敏試驗。試驗

5、選取了貴州大學(xué)送檢的17株鴨疫里默氏桿菌，進行雙重PCR鑒定、血清學(xué)鑒定和藥敏試驗。結(jié)果表明，這些分別屬于1、2、5和15型鴨疫里默氏桿菌；且所有分離自貴州大學(xué)不同血清型的鴨疫里默氏桿菌菌株都對卡那霉素耐受。此外，本實驗室常用的鴨疫里默氏桿菌如CH3、HXb2、Yb2和WJ4等也均對卡那霉素耐受。
　　試驗三是將鴨疫里默氏桿菌的Yb2株為受體菌，將質(zhì)粒pEP4351轉(zhuǎn)入大腸桿菌BW19851，構(gòu)建得到BW19851（pEP4351

6、）作為供體菌，通過結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的濾膜接合轉(zhuǎn)移法技術(shù)將質(zhì)粒pEP4351導(dǎo)入受體菌鴨疫里默氏桿菌Yb2株中，使轉(zhuǎn)座子Tn4351隨機插入鴨疫菌株的基因組中。由于Tn4351上有紅霉素抗性基因和Yb2對多黏菌素耐藥，通過微量肉湯稀釋法測定鴨疫和大腸桿菌BW19851對紅霉素和多黏菌素的最小抑菌濃度（MIC），以紅霉素0.3μg/mL和多粘菌素125μg/mL進行陽性接合子的篩選。構(gòu)建的隨機突變庫，通過卡那霉素抗性實驗來對突變株進行篩選，初步尋找

7、到鴨疫卡那霉素抗性減弱的突變株，對突變株的最小抑菌濃度進行檢驗，以確定突變株是否對卡那霉素失去耐藥性或耐藥明顯減弱。對驗證后的突變株結(jié)果觀察，篩選到了卡那霉素耐藥性明顯減弱的突變株DK-2。采用基因組步移法擴增測定轉(zhuǎn)座子的插入位點在核糖體50S的L27亞基。
　　PCR擴增野生株的50S L27基因ORF，連入大腸桿菌-鴨疫里默式桿菌穿梭表達載體pRES51，得到互補質(zhì)粒pRES-50S-L27，然后通過接合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將互補質(zhì)粒導(dǎo)

8、入突變株DK-2中，通過紅霉素和多黏菌素抗性篩選和PCR檢測鑒定，得到了互補菌株cDK-2。然后測定野生株、突變株和互補株的生長曲線和藥敏試驗。結(jié)果表明，野生株、突變株及其基因互補株的生長曲線差異不大；但DK-2的MIC比野生株Yb2和cDK-2低8倍左右。回復(fù)株cDK-2和野生株Yb2的卡那霉素藥敏片直徑為0，對kana是耐受的；而突變株DK-2的卡那霉素藥敏片直徑為10mm，表現(xiàn)對kana有低度敏感。另外，與野生株Yb2和互補株cD