腸炎沙門氏菌對雞細(xì)胞自噬的影響及其Fe3O4--MNP調(diào)控作用研究.pdf

1、本試驗(yàn)旨在從細(xì)胞自噬角度研究四氧化三鐵磁性納米粒子(Fe3O4 Magnetic Nanoparticles，F(xiàn)e3O4-MNP)對禽源細(xì)胞腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis，SE）感染結(jié)局的調(diào)控作用。
　　試驗(yàn)一:腸炎沙門氏菌感染誘導(dǎo)LMH細(xì)胞自噬的研究。選擇雞肝癌細(xì)胞（LMH細(xì)胞）為研究對象，構(gòu)建了SE感染模型。于感染后24 h(24 hours post infection，24 hpi)收集細(xì)胞，以

2、透射電鏡(Transmission electron microscope，TEM)和Western-blot(WB)方法檢測自噬的發(fā)生情況，結(jié)果表明:SE SC070株感染條件為感染劑量5×107cfu/mL、感染時(shí)間1h時(shí)，大部分LMH細(xì)胞都有SE侵入，而細(xì)胞狀態(tài)不受太大影響，未出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)松散或細(xì)胞崩解;TEM結(jié)果顯示，SE感染組LMH細(xì)胞內(nèi)可見大量包裹SE的的自噬結(jié)構(gòu)，而對照組LMH細(xì)胞內(nèi)未見明顯自噬結(jié)構(gòu);WB結(jié)果顯示SE感染組L

3、C3-Ⅱ/β-actin比值顯著高于對照組（P＜0.05），p62/β-actin比值極顯著低于對照組（P＜0.01）。
　　試驗(yàn)二:Fe3O4-MNP對腸炎沙門氏菌的調(diào)控作用。在SE SC070株感染LMH細(xì)胞后，添加不同劑量（50、100、200、400μg/mL）的Fe3O4-MNP進(jìn)行處理，同時(shí)設(shè)置不添加Fe3O4-MNP處理的對照組。于感染后不同時(shí)間點(diǎn)收集LMH細(xì)胞，通過CCK-8法檢測細(xì)胞活性，平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)胞內(nèi)菌數(shù)量

4、。結(jié)果顯示:6 hpi時(shí)，與對照組相比，各劑量的Fe3O4-MNP處理均對胞內(nèi)菌數(shù)量無顯著影響（P＞0.05），200μg/mL和400μg/mL兩組顯著降低了細(xì)胞活性(P＜0.05);12 hpi時(shí)，與對照組相比，各劑量的Fe3O4-MNP處理均極顯著降低了胞內(nèi)菌數(shù)量(P＜0.01)，100μg/mL組有增加細(xì)胞活性的趨勢(P＞005)，50μg/mL和200μg/mL兩組對細(xì)胞活性無顯著影響(P＞0.05)，400μg/mL組顯著抑

5、制了細(xì)胞活性(P＜0.05);18 hpi時(shí)，與對照組相比，各劑量Fe3O4-MNP均極顯著降低了胞內(nèi)菌數(shù)量(P＜0.01)，50μg/mL組對細(xì)胞活性無顯著影響(P＞0.05)，而100、200和400μg/mL三組均極顯著降低了細(xì)胞活性(P＜0.01);24hpi時(shí)，與對照組相比，各劑量Fe3O4-NPs均極顯著降低了胞內(nèi)菌數(shù)量和細(xì)胞活性(P＜0.01)，且劑量為400μg/mL時(shí)最低;30hpi時(shí)，與對照組相比，各劑量Fe3O4-

6、MNP均極顯著降低了胞內(nèi)菌數(shù)量和細(xì)胞活性(P＜0.01)，且劑量越大，胞內(nèi)菌數(shù)量越少，細(xì)胞活性越弱。
　　試驗(yàn)三:自噬在Fe3O4-MNP調(diào)控腸炎沙門氏菌感染中的作用研究。在SE SC070株感染LMH細(xì)胞后，添加100μg/mL的Fe3O4-MNP進(jìn)行處理（SN組），同時(shí)設(shè)置不添加Fe3O4-MNP處理的對照組（SE組）。于12 hpi收集細(xì)胞，以TEM和WB方法檢測自噬的發(fā)生情況，結(jié)果表明:WB結(jié)果顯示SN組LC3-Ⅱ/β-a

7、ctin比值顯著高于SE組(P＜0.05)，p62/β-actin比值顯著低于SE組（P＜0.05）;TEM結(jié)果顯示，與SE組相比，SN組胞漿內(nèi)除了可見包裹SE的自噬結(jié)構(gòu)外，還可見包裹SE和Fe3O4-MNP的自噬結(jié)構(gòu)。
　　綜上所述:本試驗(yàn)中SE感染模型構(gòu)建的合適條件為:感染劑量為5×107 cfu/mL，細(xì)菌和細(xì)胞共培養(yǎng)1 h;SE感染能夠誘導(dǎo)禽源細(xì)胞LMH發(fā)生自噬。Fe3O4-MNP能夠緩解LMH細(xì)胞SE感染，且劑量為100