SacB基因在紫花苜蓿中的轉化和植株再生的研究及PCR擴增條件的確立.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本研究以三個苜蓿品種(和田苜蓿、甘農(nóng)3號和隴東苜蓿)為受體材料,采用農(nóng)桿菌介導法進行SacB基因在苜蓿中轉化的研究,并探索了轉化植株再生條件及其再生過程中的褐化因素,篩選出卡那霉素抗性植株。進一步對轉化組織進行了PCR檢測,優(yōu)化了PCR檢測條件,確立了適宜的PCR擴增條件。主要研究內容及結果如下:
   1.建立了苜蓿三個品種基因轉化體系。
   以和田苜蓿、甘農(nóng)3號和隴東苜蓿的下胚軸為外植體,以農(nóng)桿菌介導法為轉化方法,

2、進行了SacB基因的轉化。系統(tǒng)研究了Kan對苜蓿組織生長的影響、Kan篩選時期和篩選濃度、菌液濃度、侵染時間及預培養(yǎng)時間。結果表明:Kan對苜蓿種子萌發(fā)的影響不顯著:愈傷分化階段是最適宜的篩選階段,和田苜蓿、甘農(nóng)3號、隴東苜蓿的選擇壓分別為80mg/L、60mgL、60mg/L。生根階段,3個品種的Kan選擇壓分別為100mg/L、80mg/L、80mg/L。甘農(nóng)3號、和田苜蓿、隴東苜蓿適宜的菌液的OD值分別為0.6、0.5和0.4。紫

3、花苜蓿轉化前不需要進行預培養(yǎng),適宜的侵染時間為10min。
   2.分析探討了轉化組織在冬夏兩季再生過程中出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象,提出了相應的解決的辦法。
   培養(yǎng)物的褐化程度具有季節(jié)性差異。2,4-D的最佳作用天數(shù)為15-20d,愈傷誘導、分化再生和生根階段蔗糖的最佳濃度分別為30g/L、20g/L和10g/L?;蛐陀绊懪囵B(yǎng)物的褐化程度,褐化程度順序為隴東苜蓿>和田苜蓿>甘農(nóng)3號。培養(yǎng)溫度冬季以恒溫25℃為宜,夏季以白天

4、23℃+黑夜21℃為宜。光照以3000Lux左右為宜。NAA的濃度在夏季應較冬季適當降低,IBA誘導生根適宜在冬季使用,生根率高,且褐化少。
   3.優(yōu)化了PCR反應條件,對轉化組織進行了PCR檢測。
   對轉化體進行PCR檢測,結果表明:最佳引物為a組引物;最佳退火溫度為52℃:25ul的反應體系中,dNTP、Mg2+、TaqDNA的最佳用量分別是2.0ul、2.5ul和0.4ul。在選取的50個抗性愈傷中,僅有1

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