短小芽孢桿菌BSH-4抗菌蛋白的理化性質(zhì)分析及初步分離.pdf

1、為進(jìn)一步了解短小芽孢桿菌BSH-4菌株的拮抗作用機(jī)制，以黃瓜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum為指示菌測(cè)定了該菌株抗菌蛋白的抗菌活性，優(yōu)化了發(fā)酵條件，對(duì)抗菌蛋白進(jìn)行了抗菌譜測(cè)定、理化性質(zhì)分析，初步研究了抗菌蛋白的分離條件，從而為進(jìn)一步生防應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 1.為明確BSH-4菌株及其抗菌蛋白的抑菌譜，采用平板對(duì)峙法和平板打孔法分別測(cè)得此菌株及其抗菌蛋白的抗菌活性。結(jié)果表明，此菌株及其抗菌蛋白對(duì)黃瓜菌核病菌、黃

2、瓜猝倒病菌、黃瓜蔓枯病菌、黃瓜枯萎病菌、黃瓜立枯病菌、番茄早疫病菌、辣椒疫病病菌、茄子綿疫病菌等8種常見(jiàn)蔬菜病原真菌均具有抑菌活性。且經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后，此菌株的抑菌活性基本不變。 2.為提高短小芽孢桿菌BSH-4產(chǎn)生抗菌蛋白的能力，采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)BSH-4發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，此菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：玉米淀粉2％，酵母浸膏2％，CaCl20.4％；最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間48h，搖瓶轉(zhuǎn)

3、速180r/min，培養(yǎng)溫度37℃，初始pH值6.0，接種量6％，裝液量25mL(50mL三角瓶)。在此優(yōu)化條件下，BSH-4經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的抗菌蛋白的濃度為16.8μg/mL。 3.為明確短小芽孢桿菌BSH-4抗菌蛋白的理化性質(zhì)，研究了溫度、pH值、紫外照射、有機(jī)溶劑、金屬離子及蛋白酶對(duì)其穩(wěn)定性的影響，并以不同培養(yǎng)基為底物對(duì)該蛋白的功能進(jìn)行初步判斷。結(jié)果表明，該抗菌蛋白粗提液具有良好的熱穩(wěn)定性，100℃處理1h后仍具有對(duì)照活性的9

4、0％左右；對(duì)酸堿較敏感，在pH值6-9時(shí)活性較高；對(duì)紫外線穩(wěn)定，在紫外光下照射10h以上時(shí)，其活性基本不受影響；對(duì)乙醚、丙酮、乙酸乙酯和氯仿不敏感，其活性基本不變，而對(duì)甲醇較敏感，其活性下降20％以上；對(duì)重金屬離子敏感，濃度為10mmol/L的Ag+、Cu2+、Zn2+能夠降低活性的40％左右；對(duì)蛋白酶較穩(wěn)定。底物特異性試驗(yàn)表明該蛋白不是幾丁質(zhì)酶、羧甲基纖維素酶和β-1，3-葡聚糖酶。 4.初步研究了短小芽孢桿菌BSH-4抗菌蛋

5、白對(duì)核盤(pán)菌的抑菌機(jī)制，采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了其對(duì)黃瓜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum菌絲生長(zhǎng)的毒力，及其對(duì)菌絲形態(tài)、菌核形成、菌核萌發(fā)和菌體細(xì)胞膜透性的影響。結(jié)果表明，此抗菌蛋白粗提物對(duì)核盤(pán)菌菌絲生長(zhǎng)的EC50值為10.1μg/mL，明顯低于對(duì)照藥劑乙霉威及腐霉利；經(jīng)此抗菌蛋白處理后，菌絲形態(tài)出現(xiàn)黃化、畸形等現(xiàn)象，但尚未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)外滲；菌核形成的時(shí)間有所延長(zhǎng)，數(shù)量有所減少，且重量略有降低；在此抗菌蛋白粗提物濃度