三種木腐菌木材降解相關(guān)酶以及相關(guān)基因TRAP標(biāo)記的變異.pdf

1、本研究以黑龍江省東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)的3種典型木材腐朽菌為實(shí)驗(yàn)材料,包括樺剝管菌一種褐腐菌,木蹄層孔菌和彩絨革蓋菌兩種白腐菌,以其木質(zhì)素降解相關(guān)酶類為主要研究對(duì)象,比較3種木材腐朽菌的LiP、MnP、Lac在不同培養(yǎng)條件下的生理特性;并且采用TRAP分子標(biāo)記的手段,篩選LiP、MnP、Lac、CBHⅡ、CDH編碼基因的引物,分析這些編碼基因的多態(tài)性,證明TRAP分子標(biāo)記可以應(yīng)用于木腐菌的遺傳分析。
　　 常溫條件下,彩絨革

2、蓋菌表達(dá)3種木質(zhì)素相關(guān)酶的能力明顯高于樺剝管菌和木蹄層孔菌。不同木腐菌的木質(zhì)素降解相關(guān)酶的表達(dá)受各種因素的影響情況各不相同。HCLN培養(yǎng)基對(duì)3種木腐菌LiP的表達(dá)都有促進(jìn)作用,LCHN培養(yǎng)基對(duì)3種木腐菌MnP的表達(dá)都有所促進(jìn),HCLN培養(yǎng)基能夠在培養(yǎng)早期促進(jìn)3種木腐菌Lac的表達(dá),而HCHN條件能夠在木蹄層孔菌生長(zhǎng)的后期促進(jìn)其表達(dá)lac。3種木腐菌表達(dá)木質(zhì)素降解相關(guān)酶的最適pH不同,樺剝管菌和木蹄層孔菌表達(dá)LiP的最適pH為5.0,而彩

3、絨革蓋菌表達(dá)LiP的最適pa為4.5。偏酸和偏堿條件在一段時(shí)間內(nèi)對(duì)3種木腐菌MnP的表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用。樺剝管菌表達(dá)Lac的最適pH是4.5,彩絨革蓋菌表達(dá)Lac的最適pH為5.5,而木蹄層孔菌在pH為6.5時(shí)Lac的表達(dá)量最多。適當(dāng)增加的Mn2+濃度對(duì)3種木腐菌LiP的表達(dá)有抑制作用。對(duì)于木蹄層孔菌和彩絨革蓋菌,MnP活性隨 Mn2+濃度的增加而增加,當(dāng)Mn2+＞1.25mmol/L時(shí)MnP活性隨濃度的增加而降低。Mn2+濃度的增加

4、抑制樺剝管菌表達(dá)Lac,促進(jìn)木蹄層孔菌表達(dá)Lac,而對(duì)彩絨革蓋菌Lac的表達(dá)未起到明顯影響。熱激條件抑制3種木腐菌表達(dá)LiP和Lac;促進(jìn)MnP的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)改良了CTAB法提取3種木腐菌的基因組DNA的方法。確定了3種木腐菌TRAP分子標(biāo)記的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。TRAP-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系為:總體積20μL,DNA模板2.0μL(約100ng),固定引物(10μM)2.0μL,隨機(jī)引物(10μM)2.0μL,dNTP(

5、20mM)2.0μL,MgCl2(25mM)2.0μL,1×buffer2.0μ L,Taq酶0.15μ L,去離子水7.85μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,35℃退火1min,72℃延伸1min,5個(gè)循環(huán);94℃變性1min,56℃退火1min,72℃延伸1.5min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸7min;4℃保存。經(jīng)過(guò)對(duì)32對(duì)引物進(jìn)行篩選試驗(yàn),共確定11對(duì)引物,包括3對(duì)標(biāo)記MnP編碼基因的引物、3對(duì)標(biāo)記Lac編