HD-3復(fù)方中草藥對凡納濱對蝦免疫酶影響和抗WSSV感染分析.pdf

1、隨著國內(nèi)外學(xué)者對對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）的研究深入，在病原分子基因水平、感染傳播和對蝦免疫保護(hù)方面取得了豐碩的研究成果，但在防控技術(shù)上未能獲得理想的防治效果。本實驗旨在調(diào)查了解養(yǎng)殖凡納濱對蝦 WSSV檢出率和發(fā)病情況，應(yīng)用前期篩選的抗WSSV專用中草藥HD-3進(jìn)行感染臨床試驗，通過統(tǒng)計分析對蝦死亡率和對蝦免疫酶活數(shù)據(jù)，結(jié)合熒光定量 PCR、組織病理學(xué)檢測和超微病理學(xué)檢測，確定投喂中草藥的最佳預(yù)防方案，并開展中試試驗檢驗生產(chǎn)療效。<

2、br>　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴在2014年7月-2015年12月，對遼寧、河北、天津、山東和浙江五省份，楊家泊、濱州、濰坊、膠南等環(huán)黃渤海凡納濱對蝦主產(chǎn)區(qū)，共采集29批次樣品。每個養(yǎng)殖場樣品定義為同一批次，進(jìn)行 WSSV病原攜帶率和養(yǎng)殖工藝調(diào)查。通過DNA提取，利用套式PCR和熒光定量PCR診斷凡納濱對蝦的WSSV陽性率。結(jié)果顯示，在北方凡納濱對蝦主要產(chǎn)區(qū)通過套式PCR方法，WSSV陽性檢出率高達(dá)72.4％；通過熒光定量方法，WSSV

3、檢出率達(dá)86.2%。熒光定量檢測方法敏感度在101copies/mg優(yōu)于套式PCR。傳統(tǒng)土塘養(yǎng)殖工藝凡納濱對蝦WSSV檢出率和感染程度高于大棚養(yǎng)殖和工廠化養(yǎng)殖模式。⑵基礎(chǔ)飼料添加3%HD-3復(fù)方中草藥做藥餌，每天2次投喂量占對蝦體重5%，水體溫度25~28℃，鹽度18~20‰，溶解氧6.5mg/L以上。投喂1d、4d、7 d、10d、13d、16d和19d藥餌后進(jìn)行口服WSSV毒餌感染方式攻毒，統(tǒng)計對蝦癥狀表現(xiàn)和死亡率，測定對蝦酚氧化酶

4、（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）四種免疫因子。結(jié)果顯示：在飼料中添加HD-3中草藥，可以起到保護(hù)對蝦的作用，預(yù)防13d、16d和19d在試驗結(jié)束后仍有存活對蝦，其中實驗組16d獲得最高的免疫保護(hù)率，達(dá)到36.7±3.3%，存活者健康與空白對照組對蝦無異。服用HD-310d以后，可以顯著提高對蝦PO、SO D和AKP活力（P<0.05），緩慢提升ACP活力（P>0.05）。攻毒后服用較長時間中

5、草藥的實驗組對蝦，PO、SOD、AKP和ACP活力可以獲得更持久的免疫活性。⑶通過熒光定量對陽性對照組和各實驗組不同感染時期凡納濱對蝦腮組織內(nèi)病毒進(jìn)行定量分析，顯示隨著服用中草藥時間的延長，對蝦體內(nèi)病毒增長幅度和最大峰值總體上低于陽性對照組。在感染72h后，陽性對照組病毒含量達(dá)到106 copies/mg峰值時，服用中草藥10d以后實驗組病毒含量顯著小于陽性對照組（P<0.05），仍在104 copies/mg數(shù)量級。而存活對蝦體內(nèi)病毒

6、含量整體較低，處于103 copies/mg數(shù)量級以下。通過組織病理觀察統(tǒng)計細(xì)胞核腫大程度（SOI），發(fā)現(xiàn)SOI與WSSV感染程度成正比，在腮組織和胃組織內(nèi)，實驗組10d-19d在感染后 SOI整體上低于陽性對照組，表現(xiàn)出良好的保護(hù)率。并且攻毒后存活對蝦 SOI大多處于中度感染以下。在超微組織病理分析中，陽性對照組中，腮、胃和甲殼下表皮中受WSSV感染細(xì)胞數(shù)目和完整WSSV病毒含量明顯多于用藥組的存活對蝦。在用藥組中對蝦病毒形態(tài)多表現(xiàn)為

7、大多數(shù)細(xì)胞完整，有稀疏、少量的病毒粒子存在，囊膜和核衣殼組裝多數(shù)不完整，亞細(xì)胞器諸如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等較清晰完整。超微電鏡觀察結(jié)果與熒光定量和 SOI結(jié)果相符，推測該中草藥HD-3對阻斷WSSV侵染和細(xì)胞內(nèi)增殖有顯著效果。⑷將抗WSSV中草藥HD-3在WSSV陽性檢出的對蝦養(yǎng)殖場進(jìn)行中試試驗，試驗周期28天。經(jīng)過整個養(yǎng)殖周期，對蝦沒有爆發(fā)白斑綜合征，由統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析顯示，抗 WSSV中草藥實驗組顯著提高了對蝦的增重率和成活率（P<0.05）