禽多殺性巴氏桿菌6-PGD原核表達及其初步應(yīng)用.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩52頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)

文檔簡介

1、禽巴氏桿菌病又稱為禽霍亂,是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的一種急性、接觸性敗血性傳染病,對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展有著嚴重的影響。由于Pm血清型眾多,尋找新的疫苗抗原,研制新型安全、高效多殺性巴氏桿菌亞單位疫苗尤為重要。6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6-PGD)為細菌糖代謝中磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶,在細菌代謝過程中通過調(diào)控5-磷酸核糖和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的生成,進而調(diào)控細菌的生長與繁殖。通過對多殺性巴氏桿菌

2、C48-1菌株的6-磷酸葡萄糖脫氫酶的原核表達,初步建立間接ELISA檢測方法和重組蛋白免疫保護性的研究。
  1.參照KEGG中己發(fā)表的Pm70菌株的6-PGD基因序列(登錄號:T00046),設(shè)計引物,以本實驗室保存的C48-1菌株的全基因組模板,用PCR的方法成功擴增出6-PGD基因的全序列,該片段長度為1453bp。將目的基因插入原核表達載體PET-28a,成功構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒PET-28a-6PGD。測序結(jié)果表明:擴增

3、序列與GenBank上所報道的Pm70菌株、3480菌株、HN06菌株、ATCC43137菌株、HB03菌株同源性均達到99%。
  2.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3),在IPTG誘導(dǎo)下表達目的蛋白,目的蛋白的大小約為53kD,與預(yù)期結(jié)果相符。進一步優(yōu)化誘導(dǎo)時間,并檢測目的蛋白在37℃和16℃的可溶性。Western-blot結(jié)果表明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性,為進一步研究其免疫保護功能和間接ELISA方法的初步建立奠

4、定了基礎(chǔ)。
  3.試驗應(yīng)用純化的6-PGD重組蛋白為包被抗原初步建立間接ELISA檢測方法。初步優(yōu)化間接ELISA最佳反應(yīng)條件,即抗原包被濃度為10μg/mL,37℃放置2h,4℃過夜,最佳封閉液為5%脫脂奶粉,封閉時間為30min,血清稀釋度為1:200,酶標二抗按1:60000稀釋,血清和酶標二抗的孵育時間分別為30min和60min,批間重復(fù)和批內(nèi)重復(fù)實驗的變異系數(shù)均在0.433%-7.23%,阻斷試驗的阻斷率均大于50%

5、。
  4.將純化后的重組蛋白和C48-1滅活全菌用白油佐劑制成疫苗免疫雞,同時設(shè)生理鹽水為陰性對照組。免疫兩次,間隔時間為兩周,用間接 ELISA方法檢測血清抗體水平。結(jié)果表明重組蛋白組的抗體水平明顯高于全菌滅活苗組和對照組。首免后第7周C48-1強毒株以10LD50攻毒,結(jié)果顯示:全菌滅活苗組能夠提供100%的保護,重組蛋白組保護率為60%,生理鹽水組則完全沒有保護力。
  綜上所述:建立的間接ELISA方法可用于臨床樣

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論