PRRSV GP2和M蛋白免疫活性及其在感染細(xì)胞內(nèi)分布的初步研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PorcineReproductiveandRespirationSyndrome，PRRS）是以妊娠母豬繁殖障礙及各年齡階段豬呼吸道癥狀為主要特征的傳染病。其病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PorcineReproductiveandRespirationSyndrome，PRRSV）基因組中一共有6種結(jié)構(gòu)蛋白基因，分別由ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因編碼病毒的GP2、GP3、GP4、G

2、P5、M蛋白和N蛋白，其中M蛋白是主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有很強(qiáng)的免疫原性，用體外表達(dá)的重組M蛋白可以作為血清學(xué)試驗(yàn)的靶抗原，但是，該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能還不是很清楚；GP2蛋白是次要結(jié)構(gòu)蛋白，目前關(guān)于GP2蛋白功能研究的報(bào)道仍然很少。所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)PRRSVHn-1/06株的GP2和M蛋白進(jìn)行了初步研究。 本研究利用RT-PCR從PRRSV河南分離株Hn-1/06克隆得到了大小約525bp片段的ORF6基因和771bp片段的ORF2基因，并

3、將擴(kuò)增的基因片段克隆到pTG19-T載體中進(jìn)行測(cè)序。利用DNAStar軟件進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明河南分離株Hn-1/06屬于美洲型，同時(shí)將Hn-1/06株ORF6和ORF2基因的核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列與ATCCVR2332、LV、Resp、CH-1a、BJ-4、S1、CC-1、HB-1、JX0612、HUB1等分離株進(jìn)行了同源性分析，Hn-1/06株與空間距離較近的JX0612、HUB1同源性極高，核苷酸同源性能達(dá)到99％以上，推導(dǎo)

4、氨基酸同源性達(dá)98％以上；而與空間距離較遠(yuǎn)的Resp、CC-1同源性次之。這在一定程度上說明了PRRSV的同源性與空間距離密切相關(guān)，空間距離越近同源性越高；反之，空間距離越遠(yuǎn)同源性越小。 根據(jù)PRRSV河南分離株Hn-1/06株ORF6和ORF2基因設(shè)計(jì)表達(dá)引物，擴(kuò)增出兩端帶有BamH-Ⅰ/HindⅢ酶切位點(diǎn)的ORF6基因和BamHⅠ/XhoⅠ酶切位點(diǎn)的ORF2基因，將其亞克隆到原核表達(dá)載體pET32a和pGEX-6p-1中構(gòu)建

5、了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-dORF6和pGEX-dORF2，在IPTG的誘導(dǎo)下成功表達(dá)，獲得了大小分別約為29KD、44KD的融合蛋白rdM和rdGP2，與預(yù)期結(jié)果相符；通過對(duì)表達(dá)條件進(jìn)一步優(yōu)化，獲得了融合蛋白的高效表達(dá)。應(yīng)用純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳和Westernblot鑒定，目的蛋白純度高達(dá)90％，并具有良好的免疫學(xué)活性。 用GP2和M融合蛋白免疫小鼠，獲得了鼠抗重組GP2和M蛋白抗體。通過本實(shí)驗(yàn)室建立的間接E

6、LISA及IFA方法對(duì)鼠抗重組GP2和M蛋白抗體的免疫活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示鼠抗GP2和M重組蛋白抗體的效價(jià)分別為1：10和1：20，且沒有中和活性。用本人建立的IFA方法對(duì)GP2和M蛋白在PRRSV感染的Marc-145細(xì)胞內(nèi)的分布進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，在PRRSV感染24h即可檢測(cè)到M蛋白，且可隨時(shí)間的增加有所增加，但未檢測(cè)到GP2蛋白。鼠源抗體的制備及IFA方法的建立，為GP2和M蛋白的生物學(xué)和免疫學(xué)功能方面的研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)