以LTb為分子內(nèi)佐劑的PRRSV-gp5蛋白免疫特性研究.pdf

1、本研究對PRRSV新型疫苗設(shè)計進(jìn)行了新的探索，構(gòu)建了以LTb為分子內(nèi)佐劑的PRRSV-GP5融合蛋白，經(jīng)動物免疫試驗，闡明LTb的分子佐劑作用，為研究新型PRRS疫苗探尋新途徑。主要研究內(nèi)容如下： 1.PRRSV ORF5基因的克隆、表達(dá)與免疫印跡將PRRSV ORF5基因克隆入原核表達(dá)載體pET-28a(+)的多克隆位點中，經(jīng)鑒定后得到重組質(zhì)粒pET-ORF5，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到受體菌BL21(DE3)中，并用誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行

2、誘導(dǎo)表達(dá)，2小時后表達(dá)量達(dá)到高峰。經(jīng)15％SDS-PAGE電泳檢測，表達(dá)得到的蛋白大小為13.75KD。經(jīng)western Blotting分析，表達(dá)蛋白能與PRRSV陽性豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而與陰性血清不反應(yīng)。 2.E coli LTb與PRRSV gp5融合基因克隆，表達(dá)與免疫印跡采用PCR重疊延伸技術(shù)將LTb和PRRSV ORF5基因通過柔性連接進(jìn)行融合后，克隆入原核表達(dá)載體pET-28a(+)的多克隆位點中，經(jīng)鑒定后得到

3、重組質(zhì)粒pET-LTb-gp5，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到受體菌BL21(DE3)中，并用誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)蛋白2小時后表達(dá)達(dá)到高峰。經(jīng)15％SDS-PAGE電泳檢測，表達(dá)得到的蛋白大小為26KD。經(jīng)Western Blotting分析，表達(dá)蛋白均能與PRRSV陽性豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而與陰性血清不反應(yīng)。 3.gp5蛋白與LTb-gp5融合蛋白免疫效果的比較將表達(dá)產(chǎn)物gp5蛋白及融合表達(dá)的LTb-gp5蛋白免疫6-8周齡I

4、CR小鼠，并設(shè)對照組用間接ELISA法和MTT法檢測小鼠血清中特異性抗體水平以及脾臟中T、B淋巴細(xì)胞增殖功能。結(jié)果gp5蛋白以肌肉注射途徑免疫效果較好；三免后gp5特異性抗體達(dá)到較高水平，其中LTb-gp5 IM與gp5+氟氏佐劑組之間差異不顯著，而這兩組與gp5 IM差異顯著；從抗體種類來說，LTb-gp5三免后達(dá)到和gp5+氟氏佐劑組相同的三種抗體亞型，而gp5 IM仍然是一種抗體亞型。Lab-gp5 IM、gp5+氟氏佐劑組和gp

5、5 IM均能夠誘導(dǎo)脾臟T，B淋巴細(xì)胞增殖；LTb-gp5 IM、gp5+氟氏佐劑組均顯著高于gp5 IM。 4.大腸桿菌LTb蛋白單克隆抗體的制備和鑒定將大腸桿菌不耐熱腸毒素LTb基因去除信號肽后與載體pPIC9K連接，電轉(zhuǎn)化入酵母菌SMD1168中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。用純化的LTb表達(dá)蛋白免疫6周齡BALB/c鼠3次，取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合后，以間接ELISA和有限稀釋法進(jìn)行篩選，獲得4株能穩(wěn)定分泌抗大腸桿菌LTb單