大豆低豐度蛋白的分離、鑒定及其提取物對小鼠的生理效應(yīng)研究.pdf

1、在大豆中表達(dá)量較少的大豆低豐度蛋白，因受傳統(tǒng)提取方法的限制及檢測時(shí)高豐度蛋白的遮蔽作用，使其提取及鑒定成為大豆蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一大挑戰(zhàn)。因此，本研究對大豆低豐度蛋白的提取方法進(jìn)了優(yōu)化，并試圖在鑒定提取物成分的基礎(chǔ)上揭示大豆低豐度蛋白提取物對斷奶小鼠的生理功能效應(yīng)（無大豆高豐度蛋白干擾）。
　　1大豆低豐度蛋白的分離、鑒定
　　本研究探究了異丙醇濃度、超聲功率、超聲時(shí)間和總提取時(shí)間等因素對大豆低豐度蛋白分離的影響，優(yōu)化了其提取

2、條件，并對最佳條件下的提取物成分通過SDS-PAGE、MS及液相、氣相色譜等方法進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示:(1)50％異丙醇去除大豆高豐度蛋白的效果較好，超聲功率400 W、超聲10 min和提取1h（超聲時(shí)間+水浴震蕩）分別是大豆低豐度蛋白的最佳提取單因素條件，且超聲處理的作用遠(yuǎn)大于總提取時(shí)間的。(2)大豆低豐度蛋白提取、富集的最佳條件為:50％異丙醇，超聲功率350 W，超聲15 min，提取1h。(3)大豆低豐度蛋白提取物中檢測到一些

3、無法通過常規(guī)提取法獲得的低豐度蛋白如磷酸酯-D、β-淀粉酶、16.5 KD油質(zhì)蛋白、無特征大豆蛋白和未知大豆蛋白，且無高豐度蛋白（大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白）和大豆異黃酮，而異丙醇和丙酮的殘留量分別僅為0.0231％和0.0430％。
　　2大豆低豐度蛋白提取物（以下簡稱提取物）對小鼠生長性能的影響
　　選用180只21日齡ICR斷奶小鼠，分成5組（對照和D0.5mg，D1mg，D2mg，D4mg等4個(gè)處理組，mg代表灌胃

4、液中的低豐度蛋白量），每組3個(gè)重復(fù)。飼喂AIN93G標(biāo)準(zhǔn)化小鼠純合日糧1周以適應(yīng)環(huán)境，28日齡開始灌胃試驗(yàn)，探究不同劑量提取物對小鼠生長性能的影響。結(jié)果顯示:(1)各試驗(yàn)期處理組小鼠的體重均高于其對照，且D2mg組最高。(2)除1-7 d外，其他試驗(yàn)期處理組小鼠的日增重、肉料比和增長率均高于其對照，且D2mg組最高。(3)7 d時(shí)，E組小鼠心臟指數(shù)顯著低于對照(P＜0.05);28 d時(shí)，處理組小鼠心臟、腎臟指數(shù)均高于對照。綜上所述，大

5、豆低豐度蛋白提取物在1-7 d時(shí)對小鼠生長有一定抑制作用;隨著試驗(yàn)期的延長，提取物表現(xiàn)出明顯的促生長效果，且以D2mg組的效果最佳。
　　3提取物對小鼠免疫功能和抗氧化能力的影響
　　本試驗(yàn)旨在研究提取物對小鼠免疫功能和抗氧化能力的影響，試驗(yàn)動(dòng)物及分組等同上。結(jié)果顯示:(1)7、14、21 d時(shí)的D2mg、D4mg組小鼠血清白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)目均高于對照，且E組最高。(2)7、28 d時(shí)，各試驗(yàn)組小鼠胸

6、腺指數(shù)均無顯著差異，但各試驗(yàn)期D2mg組均低于對照;7、14、21 d時(shí)的處理組小鼠脾臟指數(shù)與其對照差異不顯著，其中各試驗(yàn)期D4mg組均高于對照;7、14、21 d時(shí)處理組的肝臟指數(shù)低于對照，28d時(shí)均高于對照。(3)各試驗(yàn)期D2mg組小鼠血清IL-2含量高于對照;7、28 d時(shí)各試驗(yàn)處理組的IL-10、IgG和TNF-α含量與對照相比無顯著差異，且28 d時(shí)的D2mg組IL-2、IgG和TNF-α含量高于其他組;7、28 d(D2mg

7、組除外)時(shí)，各試驗(yàn)處理組小鼠脾臟的IL-2、TNF-a基因相對表達(dá)量均高于對照;28d時(shí)各試驗(yàn)組間的His、D-乳酸含量無顯著差異，但D2mg組均低于對照，而7d時(shí)高于其對照。(4)28 d時(shí)各試驗(yàn)處理組小鼠血清的T-AOC含量均高于對照，各試驗(yàn)期D1mg、D2mg組小鼠血清T-AOC含量高于對照;7d時(shí)各試驗(yàn)組小鼠肝臟的SOD、CAT和GPX基因相對表達(dá)量差異不顯著，28 d時(shí)的D1mg、D2mg組高于對照。以上結(jié)果表明:7d時(shí)，灌胃

8、提取物使小鼠的機(jī)體發(fā)生了免疫反應(yīng)，導(dǎo)致其腸道一定程度受損，但對小鼠抗氧化能力無顯著影響。
　　4提取物對小鼠消化代謝相關(guān)血液指標(biāo)和基因表達(dá)的影響
　　本試驗(yàn)探究了提取物對小鼠消化代謝的影響，試驗(yàn)動(dòng)物及分組等同上。結(jié)果顯示:(1)28 d時(shí)各試驗(yàn)組小鼠血清的TC和TG含量無顯著差異，且D2mg組最低;7、14d各試驗(yàn)處理組小鼠血清的Apo-B含量均高于其對照，21、28 d各試驗(yàn)處理組均低于其對照(28 d時(shí)D0.5mg組除外

9、);7 d時(shí)D2mg組小鼠肝臟HMG-CoA、ACS、SREBP-1c和SREBP-2基因相對表達(dá)量均低于其他各處理組，28 d時(shí)D2mg組小鼠肝臟HMG-CoA、ACS在所有試驗(yàn)組中最高，而D4mg組SREBP-1c和SREBP-2最高。(2)7、14、21d各試驗(yàn)組血清GLU含量無顯著差異，28 d時(shí)各試驗(yàn)處理組均高于對照;各試驗(yàn)期D1mg、D2mg組小鼠血清胰島素水平較高，D4mg組低于對照;7d時(shí)D0.5mg、D1mg組小鼠肝臟

10、PEPCK、GCK基因相對表達(dá)量較高，而D2mg、D4mg組較低;28d時(shí)在所有試驗(yàn)組中，D4mg組PEPCK最低但GCK最高。(3)28 d時(shí)的處理組小鼠血清ALB、GLB含量和A/G與對照無顯著差異，7d時(shí)的處理組小鼠血清ALB含量與對照無顯著差異，GLB含量高于對照而A/G低于對照;7d時(shí)的處理組小鼠肝臟ALB基因相對表達(dá)量均高于其對照，28 d時(shí)的D4mg組低于其他各試驗(yàn)組。7d時(shí)的處理組小鼠血清ALT含量均低于其對照，21、2

11、8 d（D0.5mg組ALT除外）均高于其對照?？傊?，提取物通過對小鼠血清胰島素水平、肝臟代謝基因HMG-CoA、ALB和PEPCK表達(dá)量等影響改變了小鼠機(jī)體糖、脂、蛋白質(zhì)的消化代謝，且尤以D2mg組最為明顯。
　　5提取物對小鼠小腸微生物菌群的影響
　　本試驗(yàn)通過高通量測序法研究了不同劑量灌胃提取物小鼠的小腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性和組間相似性。結(jié)果表明:(1)適量(D0.5mg、D1mg、D2mg組)提取物改變了小鼠腸道的微生

12、物區(qū)系，提高了小鼠小腸內(nèi)的微生物豐富度，增加了微生物的多樣性。(2)在門的水平上，厚壁菌門(83.15％-91.96％)、藍(lán)菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門;在屬的水平上，鏈球菌屬、芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、乳酸球菌屬、Allobaculum、Chloroplast等為優(yōu)勢菌屬。(3)試驗(yàn)D2mg組乳酸菌（乳酸桿菌和乳酸球菌之和）屬所占比例最高，比對照提高25.11％，其中乳酸桿菌屬所占比例顯著高于D0.5mg、 D4mg(P