PAAS作為SDESA-ELISA標(biāo)記酶的表征及其定向進(jìn)化.pdf

1、酶聯(lián)免疫吸附分析(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay， ELISA)在臨床檢驗(yàn)、衛(wèi)生檢驗(yàn)及生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但經(jīng)典ELISA只能測(cè)定單組份且效率低?；诳焖僮儞Q光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)能實(shí)現(xiàn)光度法雙酶同測(cè)(spectrophotometric-dual- enzyme-simuLtaneous assay， SDESA)。用 ELISA基于 SDESA同步測(cè)定兩組份稱SDESA-ELISA，其使分析效

2、率加倍。酶標(biāo)儀標(biāo)配濾光片為405 nm和450 nm；SDESA-ELISA配對(duì)標(biāo)記酶為水解酶并需滿足以下條件:(1)標(biāo)記酶 A水解顯色底物 A的最大等吸收波長(zhǎng)在405nm附近，標(biāo)記酶 B所得顯色產(chǎn)物B的最大差吸收峰在405 nm附近；(2)配對(duì)標(biāo)記酶緩沖液兼容，且比活都足夠高；(3)配對(duì)標(biāo)記酶都有良好穩(wěn)定性；(4)兩種標(biāo)記酶的顯色產(chǎn)物和顯色底物對(duì)酶活性干擾可忽略。篩選發(fā)現(xiàn)4-硝基-萘基磷酸酯(4-nitro-1-naphthy lph

3、osphate，4NNPP)為底物A，大腸桿菌堿性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase， ECAP)活性和穩(wěn)定性都滿足要求，需篩選與其最適緩沖液相容且顯色底物及產(chǎn)物對(duì)活性無(wú)干擾的標(biāo)記酶B。限于最適pH，僅乙酰膽堿酯酶（acetylcholine esterase， AChE)及綠膿桿菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas aeruginosa arylsuLphatase，PAAS)為候選標(biāo)

4、記酶 B。本項(xiàng)目比較 PAAS和 AChE與ECAP配對(duì)進(jìn)行SDESA的有效性和性能差異，并建立PAAS定向進(jìn)化系統(tǒng)。
　　1.ECAP和AChE組合進(jìn)行SDESA的表征
　　ECAP水解4NNPP產(chǎn)物4-硝基-1-萘酚(4-Nitro-1-naphthyl，4NNP)在450nm附近有最大差吸收峰波長(zhǎng)，在405nm附近為最大等吸收波長(zhǎng)。AChE催化硫代乙酰膽堿(Acetylthiocholine chloride，ATCh

5、)水解后在顯色劑5，5'-二硫雙(2-硝基苯甲)（5，5-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)， DTNB）作用下產(chǎn)物為NTB，在410nm左右有最大差吸收峰波長(zhǎng)。ECAP和AChE在相同堿性Tris-HCl緩沖液中比活和穩(wěn)定性基本滿足要求。對(duì)ECAP和AChE，校正吸收后SDESA靈敏度、檢測(cè)限、線性范圍與單組份測(cè)定一致。但ATCh穩(wěn)定性差，不便于配制即開(kāi)即用試劑盒。
　　2. ECAP和PAAS組合進(jìn)

6、行SDESA的表征
　　PAAS催化對(duì)硝基苯酚硫酸鉀（4-nitrophenol potassium，4PNS)水解產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚(Nitrophenol，4PNP)最大差吸收峰在405nm左右。ECAP和PAAS在堿性DEA-HCl緩沖液中均表現(xiàn)出其最佳比活；對(duì)ECAP和PAAS進(jìn)行SDESA的靈敏度、檢測(cè)限、線性范圍與單組份測(cè)定基本一致，且顯色底物光譜性質(zhì)更匹配，顯色底物很穩(wěn)定。野生型PAAS最高比活僅為39 kU/g，37度

7、熱失活半衰期僅4天。為了靈敏度與單組份 ELISA相當(dāng)，PAAS突變體的活性需提高20倍以上且在37度15天活性保留85％以上。因此，需對(duì)PAAS進(jìn)行分子改造提高活性和穩(wěn)定性，才能與堿性磷酸酶組合用于SDESA-ELISA。
　　3. PAAS的定向進(jìn)化系統(tǒng)
　　據(jù)PAAS編碼序列全合成基因插入pET28a構(gòu)建N-端帶6His的表達(dá)載體，最后轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中表達(dá)成功。用易錯(cuò)PCR(Error-prone PCR)針

8、對(duì)PAAS的C端水解酶進(jìn)行突變獲得突變體以建立定向進(jìn)化系統(tǒng)。改變 Mg2+、Mn2+、Tm，或組合進(jìn)行易錯(cuò) PCR，再酶切、連接后將突變序列在大腸桿菌中表達(dá)得到PAAS突變體。將LB平板上單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后測(cè)序，選取突變率為0.5%-2.0%的易錯(cuò)PCR條件作為建立 PAAS突變體庫(kù)的優(yōu)選條件。已報(bào)道方法高通量篩選酶突變體庫(kù)工作量大、漏檢率高、準(zhǔn)確度低。本文建立如下的高通量篩選方案：
　　(1)48孔板高通量培養(yǎng)PAAS單克隆菌方法

9、：批內(nèi)和批間變異系數(shù)約20%，主要原因是LB平板的單克隆生長(zhǎng)差異無(wú)法消除；
　　(2)高通量堿裂解誘導(dǎo)表達(dá)后細(xì)胞。裂解液緩沖液含1.0M Tris-HCl(Ph9.0）、輔助成份吐溫-20(1/1000)和對(duì)氨基苯甲脒(2u M)。堿裂解液與PAAS菌液誘導(dǎo)表達(dá)后菌液按8:1比例混合，室溫震蕩裂解3~6小時(shí)，裂解液中酶活性達(dá)到平臺(tái)；
　　(3)在酶標(biāo)儀用96孔板中高通量測(cè)定堿裂解液中PAAS活性；
　　(4)選擇PAA