扁桃酸消旋酶高通量篩選方法的構(gòu)建及其在定向進(jìn)化中的應(yīng)用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、光學(xué)純(R)-鄰氯扁桃酸甲酯和(R)-乙?;徛缺馓宜崾切难芩幬?S)-氯吡格雷工業(yè)化生產(chǎn)過程中兩種重要的手性中間體。利用酯酶和扁桃酸消旋酶進(jìn)行動態(tài)動力學(xué)拆分制備這兩種化合物的理論收率可達(dá)100%,能夠有效解決傳統(tǒng)化學(xué)拆分過程中反應(yīng)條件苛刻、對環(huán)境造成污染等問題,契合綠色化學(xué)的理念。然而,天然扁桃酸消旋酶對拆分過程中的副產(chǎn)物(S)-鄰氯扁桃酸的催化活性非常低,在很大程度上限制了該動態(tài)動力學(xué)拆分過程的進(jìn)行。為此,本課題構(gòu)建了一種適用于扁

2、桃酸消旋酶突變體庫篩選的高通量篩選方法,并在此基礎(chǔ)上利用定向進(jìn)化的方法提高了扁桃酸消旋酶對(S)-鄰氯扁桃酸的催化活力。
  為了輔助扁桃酸消旋酶的定向進(jìn)化,本研究構(gòu)建了一種選擇性氧化系統(tǒng)用于扁桃酸消旋酶突變體庫的篩選。該方法利用一種具有絕對R構(gòu)型對映體選擇性的D-扁桃酸脫氫酶將外消旋反應(yīng)中產(chǎn)生的(R)-對映體轉(zhuǎn)化成酮酸類化合物,進(jìn)而用于后續(xù)的顯色反應(yīng)。最終成功為扁桃酸消旋酶構(gòu)建了雙酶聯(lián)動的高通量篩選方法,并且通過手性高效液相色譜

3、驗(yàn)證了該方法的有效性。
  基于這種高通量篩選方法,對惡臭假單胞菌來源的扁桃酸消旋酶進(jìn)行了定向進(jìn)化,最終獲得了一株三點(diǎn)突變體V22I/V29I/Y54F(MRDE1),其酶活比天然酶提高了3倍左右。同時(shí),為了在反應(yīng)動力學(xué)的角度解釋酶活提高的可能來源,考察了扁桃酸消旋酶及其突變體對兩種構(gòu)型底物的酶促反應(yīng)動力學(xué),結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)之間存在著一定的協(xié)同效應(yīng),并且突變體催化效率的改善主要來源于其kcat值的提高。
  最后,通過分子對

4、接和分子動力學(xué)模擬對突變體酶活提高的來源進(jìn)一步進(jìn)行了解釋。結(jié)果表明,酶與底物分子間質(zhì)子傳遞作用的增強(qiáng)和π-π相互作用的引入在突變體酶活提高中起著關(guān)鍵作用。另外,通過分子力學(xué)泊松-玻爾茲曼表面積對酶-底物結(jié)合自由能進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)靜電作用是造成突變體結(jié)合自由能降低的主要原因,說明靜電力在活性中心相互作用網(wǎng)中起著重要作用。
  研究結(jié)果表明,利用定向進(jìn)化對酶進(jìn)行改造以提高其催化性能是一種可行、有效的手段,但前提是需要一個(gè)合適的、有效的

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