疊氮基修飾的大鼠血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)及活性測定.pdf

1、目的：
　　 氨基酸決定了蛋白質(zhì)自身的結(jié)構(gòu)和活性,通過對一些天然氨基酸的化學(xué)修飾,將獨(dú)特的化學(xué)基團(tuán)引入蛋白,對于蛋白功能及活性具有很大影響。血栓調(diào)節(jié)蛋白
　　 (thrombomodulin,TM)對血栓性疾病的診斷和治療有著重要意義,將化學(xué)性質(zhì)活潑的疊氮基團(tuán)引入TM,可以進(jìn)一步的發(fā)揮其優(yōu)勢作用。本實(shí)驗(yàn)旨在以pET-28a(+)質(zhì)粒為表達(dá)載體,構(gòu)建含有重組質(zhì)粒的E.coliB834(DE3)菌株,誘導(dǎo)表達(dá)疊氮基修飾的大鼠

2、血栓調(diào)節(jié)蛋白,并對其進(jìn)行純化和活性測定。
　　 方法：
　　 1、蛋氨酸類似物2-氨基-4-疊氮丁酸(AHA)合成
　　 首先以L-蛋氨酸為起始原料經(jīng)硫甲基化、水解合成L-2-氨基-4-羥基丁酸,然后經(jīng)溴代開環(huán)、成酯、疊氮化、水解四步反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物。經(jīng)純化重結(jié)晶、干燥后,室溫密封待用。
　　 2、質(zhì)粒的提取及轉(zhuǎn)化
　　 復(fù)蘇菌株E.coliBL21(DE3),提取質(zhì)粒,并測序鑒定其DNA序列,將

3、測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliB834(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。
　　 3、含有AHA的融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
　　 將轉(zhuǎn)化成功的B834(DE3)陽性菌落接于3mlLB液體培養(yǎng)基,37℃振搖過夜,1%接種到100mlM9-20液體培養(yǎng)基中,37℃振搖過夜,4000r/min,5min,棄上清,菌體加入30mlM9-AHA液體培養(yǎng)基懸浮,4000r/min,5min,棄上清,菌體再以50mlM9-AHA重懸,3h至A600為0.

4、5,加IPTG至終濃度為0.5mmol/L。30℃誘導(dǎo)5h,分別于1h,2h,3h,4h,5h取樣,用凝膠濃度為10%的SDS-PAGE檢測,考馬斯亮藍(lán)R250染色,同時(shí)以含空載pET-28a(+)質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)及空宿主菌作為對照。
　　 4、融合蛋白的純化
　　 將融合蛋白樣品超聲破碎后離心取上清通過0.45μm微孔濾膜,以0.4ml/min流速過柱。用PBS沖洗10min,流速為1.0ml/mi

5、n,再用含有10mmol/L的GSH洗脫液洗脫融合蛋白,流速為1.0ml/min,洗脫10min。收集洗脫液于離心管中,于凝膠濃度為10%的SDS-PAGE檢測。
　　 5、融合蛋白的活性測定
　　 取30份新鮮的大鼠血漿,每份100μl,加入部分凝血活酶100μl,分別加入按100%、75%、50%、25%、0%稀釋的融合蛋白溶液,37℃預(yù)熱5min,然后加入CaCl2溶液100μl,加入的同時(shí)開始計(jì)時(shí),記錄血漿凝固時(shí)

6、間,并以同樣稀釋度的標(biāo)簽蛋白溶液作為對照。重復(fù)3組上述操作。
　　 結(jié)果：
　　 1、AHA的合成
　　 淡黃色粉末,收率:90.2%,[α]20D=+0.42(c0.8,CH3OH)。IR(KBr,cm-1):3310、2096、1591、1390、1100。1HNMR(300MHz,D20)6:3.41(t,2H,J=7.4Hz)、2.96(m,1H)、1.89(m,2H)。
　　 光譜數(shù)據(jù)與結(jié)構(gòu)相符

7、。
　　 2、質(zhì)粒的提取及轉(zhuǎn)化
　　 質(zhì)粒提取并轉(zhuǎn)化后,涂布平板,有陽性白色菌落長出,質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 3、融合蛋白的表達(dá)及純化
　　 經(jīng)SDS-PAGE分析,重組菌所在泳道有相對分子質(zhì)量約為47000的融合蛋白表達(dá),在溫度為30℃條件下,IPTG濃度為0.5mmol/L,誘導(dǎo)4h時(shí),融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)量最高。利用GSTrapFF蛋白純化預(yù)裝柱得到了純凈的融合蛋白溶液。
　　 4、蛋白的活性測

8、定
　　 以稀釋度為橫坐標(biāo),以3組重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒,對應(yīng)凝血時(shí)間的平均值為縱坐標(biāo)構(gòu)建坐標(biāo)圖。利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件,重組質(zhì)粒的凝血時(shí)間與稀釋度經(jīng)直線回歸分析有統(tǒng)計(jì)相關(guān)性(r=0.955,p＜0.05),而空載質(zhì)粒的凝血時(shí)間與稀釋度無統(tǒng)計(jì)相關(guān)性(r=-0.680,p＞0.05)?？寺”磉_(dá)的TM融合蛋白是具有生物活性的。
　　 結(jié)論：
　　 合成了蛋氨酸類似物-2-氨基-4-疊氮丁酸(AHA),其結(jié)構(gòu)經(jīng)IR、NMR確