豬瘟病毒流行毒株糖蛋白E2高變區(qū)氨基酸置換對(duì)疫苗C株獲得性免疫應(yīng)答的影響.pdf

1、豬瘟是具有高度傳染性的病毒性疾病，是養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴(yán)重的疾病之一。其病原為豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)，該病毒為具有囊膜的正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)度大約12.3 kb，包含5'和3'端非翻譯區(qū)，編碼一條含有3898個(gè)氨基酸的肽鏈，能夠被剪切為12個(gè)蛋白，其中4個(gè)為結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns、E1和E2)和8個(gè)為非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、 p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)

2、。在結(jié)構(gòu)蛋白中，E2被認(rèn)為是CSFV的主要保護(hù)性抗原。基于E2基因的CSFV基因分型結(jié)果顯示，流行毒株已經(jīng)從基因型1轉(zhuǎn)變?yōu)榛蛐?，表明主要抗原基因正在逐步發(fā)生變異。有研究表明，E2蛋白單點(diǎn)氨基酸的突變可能影響E2蛋白的抗原性，進(jìn)而改變E2蛋白與抗體反應(yīng)性，大部分影響中和反應(yīng)差異性的重要抗原特異性氨基酸殘基位于B/C抗原結(jié)構(gòu)域上。然而，有關(guān)E2基因變異是否影響CSFV弱毒疫苗的免疫效果鮮見(jiàn)研究。本研究試圖通過(guò)原核和桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)基于流

3、行毒株E2高變區(qū)AR3的突變蛋白，系統(tǒng)分析它們與疫苗C株高免血清的反應(yīng)性及其對(duì)C株免疫豬外周血單核細(xì)胞的激活效應(yīng)，以此闡明流行毒株E2蛋白變異對(duì)C株疫苗免疫效果的潛在影響。
　　原核表達(dá)屬于基因2型CSFV流行毒株QZ-07與HZ1-08的E2抗原結(jié)構(gòu)域（AD和BC區(qū)），與疫苗C株免疫的豬血清反應(yīng)性顯著低于相同區(qū)域的C株E2片段(P＜0.05)。通過(guò)基因1型和2型E2蛋白分析發(fā)現(xiàn)，E2抗原結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)高變抗原區(qū)(Antigeni

4、c region，AR)。我們通過(guò)對(duì)商業(yè)的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行改造，制備了疫苗C株、流行毒株QZ-07和HZ1-08不包含跨膜區(qū)的截短E2蛋白，以及以C株E2為骨架分別嵌合流行毒株3個(gè)AR區(qū)的重組嵌合蛋白。ELISA和免疫印跡分析結(jié)果顯示，C株E2嵌合流行毒株AR3的重組蛋白在所有重組嵌合蛋白中反應(yīng)性最差(P＜0.05)。另外，為了檢驗(yàn)流行毒株E2不同抗原區(qū)對(duì)C株疫苗免疫產(chǎn)生的細(xì)胞介導(dǎo)免疫影響，我們用不同的重組E2蛋白刺激C株疫苗免疫的

5、豬外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。通過(guò)ELISPOT和流式細(xì)胞術(shù)分析，我們發(fā)現(xiàn)C株E2嵌合不同流行毒株抗原區(qū)的重組蛋白在刺激PBMC分泌抗體和分泌IFN-γ能力上沒(méi)有顯著的區(qū)別。上述結(jié)果表明，E2蛋白主要誘導(dǎo)體液免疫，C株疫苗血清與基因2型流行毒株的E2蛋白反應(yīng)性有顯著差別，這種差別可能主要來(lái)自于AR3的變異。
　　為了進(jìn)一步探索AR3的變異在E2蛋白與C株疫苗誘導(dǎo)的

6、體液免疫之間的關(guān)系，我們選取了AR3區(qū)的10個(gè)差異顯著的氨基酸位點(diǎn)，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了以C株E2為骨架、分別攜帶流行毒株單一氨基酸置換的10個(gè)突變E2蛋白。免疫印跡結(jié)果顯示，不同突變蛋白之間及其與C株E2蛋白之間對(duì)C株血清的反應(yīng)性差異并不明顯。ELISA分析結(jié)果表明，相對(duì)于C株E2蛋白所有重組突變蛋白與C株免疫豬血清反應(yīng)能力都有降低，其中以E37N和V45Q（以AR3區(qū)域的氨基酸位置）反應(yīng)能力降低更為顯著(P＜0.05)，表明這