2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、本研究以龍眼(Dimocarpus longan Lour.)“紅核子”胚性愈傷組織(Embryogenic callus,EC)為材料,對(duì)以下8個(gè)方面進(jìn)行研究:①龍眼胚性愈傷組織CDC48基因(cell division cycle48) cDNA和DNA克?。虎贑DC48基因的原核表達(dá);③龍眼胚性愈傷組織CDC48基因的生物信息學(xué)分析;④龍眼胚性愈傷組織GPX(glutathione peroxidase) cDNA和DNA克??;⑤

2、GPX基因的原核表達(dá);⑥龍眼胚性愈傷組織GPX的生物信息學(xué)分析;⑦以龍眼UBQ和EF-1α2個(gè)基因共同作為內(nèi)參基因,利用熒光定量PCR技術(shù)分析龍眼體胚發(fā)生過(guò)程各階段培養(yǎng)物中龍眼CDC48和GPX基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化;⑧分析龍眼體胚發(fā)生過(guò)程各階段培養(yǎng)物及逆境脅迫處理下龍眼EC GPX活性變化。主要研究結(jié)果如下: 1.龍眼胚性愈傷組織CDC48基因cDNA和DNA全長(zhǎng)的獲得 以龍眼EC為材料,應(yīng)用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù),獲

3、得了龍眼胚性愈傷組織CDC48的cDNA全長(zhǎng)為為2620 bp,其中5UTR為17 bp,3'UTR為187 bp,3’端還含有13個(gè)poly(A)尾。該序列與登錄GenBank的其它植物CDC48基因有很高的同源性。序列分析發(fā)現(xiàn)拼接的cDNA含有一個(gè)2415 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼805個(gè)氨基酸,ATG為起始密碼子、TAG為終止密碼子。將此基因命名為DLCDC48,并在GenBank上登錄,登錄號(hào)為EU606206。從DNA水平克隆也

4、得到了龍眼胚性愈傷組織的CDC48基因,并且經(jīng)測(cè)序證實(shí)該基因無(wú)內(nèi)含子,在GenBank上登錄,登錄號(hào)為:FJ590953。 2.龍眼胚性愈傷組織CDC48基因原核表達(dá) 根據(jù)龍眼EC CDC48全長(zhǎng)cDNA的序列分析,在可能的ORF區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)添加限制性內(nèi)切酶的特異引物,進(jìn)行ORF片段擴(kuò)增并將其克隆到表達(dá)載體pET-28 a中。將構(gòu)建好的表達(dá)載體在大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3)中進(jìn)行融合表達(dá)。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo),SDS-PAGE

5、分析發(fā)現(xiàn)宿主菌中有一個(gè)分子量約為89 kD的新蛋白出現(xiàn)。該誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白分子量與理論推導(dǎo)龍眼EC CDC48的分子量89.5 kD相近。 3.龍眼胚性愈傷組織CDC48基因的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)龍眼胚性愈傷組織CDC48的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:CDC48蛋白的分子量是89564.8 Da,理論等電點(diǎn)pI4.92,是不具跨膜結(jié)構(gòu)域的親水性胞質(zhì)蛋白,不具有信號(hào)肽,主要定位在細(xì)胞核上,有3

6、個(gè)區(qū)域最有可能形成卷曲螺旋,由40.87%的a螺旋、15.28%的延伸鏈和43.85%的不規(guī)則卷曲組成,磷酸化位點(diǎn)有39個(gè)。保守結(jié)構(gòu)域與功能域分析龍眼CDC48具有兩個(gè)典型的ATPase模塊,以及含有CDC48特有的N端。通過(guò)功能的預(yù)測(cè)與分析,推測(cè)與細(xì)胞的分裂有關(guān)系。通過(guò)其氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析,CDC48的進(jìn)化在一定程度上反應(yīng)了植物的進(jìn)化。此外,還對(duì)CDC48酶分子三維立體結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。 4.龍眼胚性愈傷組織GP

7、X基因cDNA和DNA全長(zhǎng)的獲得 以龍眼EC為材料,應(yīng)用同源克隆結(jié)合RACE技術(shù),獲得了龍眼胚性愈傷組織GPX的cDNA全長(zhǎng)cDNA全長(zhǎng)為947 bp,5'UTR為195bp,3'UTR為245 bp,區(qū)域還含有典型的加尾信號(hào)AATAA和poly(A)尾。該序列與登錄GenBank的其它植物GPX基因有很高的同源性。序列分析發(fā)現(xiàn)拼接的cDNA含有一個(gè)504 bp的開(kāi)放閱讀框,編碼168個(gè)氨基酸,ATG為起始密碼子、TAA為終止密

8、碼子。將此基因命名為DLGPX,并在GenBank上登錄,登錄號(hào)為EU364813。從DNA水平克隆也得到了龍眼胚性愈傷組織的GPX基因,1736 bp核苷酸序列,有ATG起始密碼子和TAA終止密碼子,并在GenBank上登陸,登陸號(hào)為:EU680970。通過(guò)DNAMAN6.0軟件分析,GPX基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成,所有內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)均符合真核生物GT-AG規(guī)則。 5.龍眼胚性愈傷組織GPX基因原核表達(dá) 根據(jù)

9、龍眼EC GPX全長(zhǎng)cDNA的序列分析,在可能的ORF區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)添加限制性內(nèi)切酶的特異引物,進(jìn)行ORF片段擴(kuò)增并將其克隆到表達(dá)載體pET-28 a中。將構(gòu)建好的表達(dá)載體在大腸桿菌表達(dá)宿主BL21(DE3)中進(jìn)行融合表達(dá)。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo),SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)宿主菌中有一個(gè)分子量約為23 kD的新蛋白出現(xiàn)。本研究所用的酶切位點(diǎn)為Sacl和XhoI,把載體上額外翻譯的38個(gè)氨基酸一起表達(dá)。龍眼GPX編碼基因產(chǎn)物的理論推導(dǎo)分子量18.54 kD

10、,加上額外翻譯的氨基酸理論推導(dǎo)分子量為4.08 KD(38個(gè)氨基酸理論推導(dǎo)分子量為39.45 KD),總共為22.62KD,與本研究結(jié)果相符。 6.龍眼胚性愈傷組織GPX基因生物信息學(xué)分析 運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)龍眼胚性愈傷組織GPX基因的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:GPX蛋白的分子量是18541.16Da,理論等電點(diǎn)pI7.18,是不具跨膜結(jié)構(gòu)域的親水性胞質(zhì)蛋白,不具有信號(hào)肽,細(xì)胞主要定位在細(xì)胞質(zhì)上,有1

11、個(gè)區(qū)域最有可能形成卷曲螺旋,由27.98%的a螺旋,20.249%的延伸鏈和51.79%的不規(guī)則卷曲組成,磷酸化位點(diǎn)有13個(gè)。龍眼胚性愈傷組織GPX氨基酸序列含有PHGPX的兩個(gè)特征序列,推測(cè)所克隆到的可能是GPXs家族中保護(hù)膜免受損傷的PHGPX的cDNA序列。此外,還對(duì)GPX酶分子三維立體結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。 7.龍眼胚性愈傷組織CDC48和GPX基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析 用龍眼胚性培養(yǎng)物中UBQ和EF-1α2個(gè)基因

12、共同作為內(nèi)參基因,利用熒光定量PCR技術(shù)分析龍眼體胚發(fā)生過(guò)程各階段培養(yǎng)物龍眼CDC48和GPX基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)變化。分析結(jié)果顯示:龍眼CDC48在體胚發(fā)生過(guò)程中都有不同程度的表達(dá),其中胚性緊實(shí)球形結(jié)構(gòu)階段表達(dá)量最大,其次是胚性愈傷組織,最低的是球形胚;龍眼GPX在體胚發(fā)生過(guò)程中也均有不同程度的表達(dá),其中胚性緊實(shí)球形結(jié)構(gòu)階段表達(dá)量最大,其次是子葉胚,最低的是胚性愈傷組織。 8.龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中GPX酶活性變化 GPX活

13、性在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中也均有不同程度的表達(dá),其中胚性緊實(shí)球形結(jié)構(gòu)階段表達(dá)量最大,其次是子葉胚,最低的是胚性愈傷組織,這與龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中基因相對(duì)定量表達(dá)結(jié)果是一致的;以龍眼胚性細(xì)胞系LC2為材料,研究了在NaCl、光和溫度脅迫下龍眼胚性愈傷組織GPX酶活性的變化規(guī)律。分析結(jié)果顯示:在一定逆境脅迫下,細(xì)胞內(nèi)GPX可以起到應(yīng)答外界刺激的作用,且活性呈規(guī)律表達(dá),推測(cè)GPX活性變化與胚性細(xì)胞抗逆性正相關(guān),是植物在逆境脅迫下防御ROS傷害的主要

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