腸炎沙門氏菌SEF21和SEF14菌毛致病作用分析.pdf

1、腸炎沙門氏菌（Salmonellaenteritidis，SE）是一類寄生于人和動物腸道內(nèi)革蘭氏陰性無芽孢直桿菌，絕大多數(shù)有鞭毛能運(yùn)動。腸炎沙門氏菌不僅能夠引起肉雞生長遲緩，蛋雞產(chǎn)蛋量下降，死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且還會間接引起食用感染雞的蛋及肉制品的人食物中毒，是重要的人獸共患病原體，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。腸炎沙門氏菌的致病性與其毒力因子密切相關(guān)，這些毒力因子通過不同致病機(jī)制共同作用于宿主，引起宿主機(jī)體損害。菌毛是腸炎沙門氏菌

2、的重要毒力因子之一。腸炎沙門氏菌表達(dá)多種菌毛結(jié)構(gòu)，在感染早期它能夠影響細(xì)菌對宿主靶組織的定植和粘附，也可以通過與宿主細(xì)胞表面的受體的特異性結(jié)合引起各種應(yīng)答反應(yīng)。腸炎沙門氏菌SEF21（Ⅰ型）菌毛廣泛分布于沙門氏菌屬，而SEF14菌毛特異性表達(dá)于腸炎沙門氏菌和都伯林沙門氏菌表面，本試驗(yàn)以SEF21、SEF14菌毛為研究對象，構(gòu)建SEF21菌毛亞單位缺失株及SEF21、SEF14菌毛亞單位雙缺失株，通過體外細(xì)胞試驗(yàn)及易感動物感染試驗(yàn)比較分析

3、SEF21菌毛與SEF14菌毛在腸炎沙門氏菌感染過程中的作用，旨在揭示腸炎沙門氏菌與宿主相互作用的分子機(jī)制，為腸炎沙門氏菌的防控提供理論依據(jù)。
　　 1利用Red同源重組技術(shù)構(gòu)建SEF21菌毛主要亞單位編碼基因缺失株
　　 根據(jù)GenBank中已經(jīng)報道的S.enteritidisSEF21菌毛主要亞單位蛋白編碼基因fimA的序列，首先合成一對引物（每一條引物5'端與fimA基因同源，而3'端與pKD3質(zhì)粒上氯霉素抗性基因

4、cat同源），經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到具有氯霉素抗性基因和同源臂的產(chǎn)物，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化入腸炎沙門氏菌中，在pKD46表達(dá)的重組酶的作用下，PCR產(chǎn)物兩端的fimA基因同源序列與腸炎沙門氏菌染色體上的的同源序列發(fā)生同源重組交換，利用抗性篩選得到陽性一次重組菌。利用編碼Flp重組酶的質(zhì)粒pCP20，去除氯霉素抗性基因，最后在染色體上只留下一個FRT位點(diǎn)，得到二次重組菌，通過PCR擴(kuò)增及測序鑒定突變株的正確構(gòu)建。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了腸炎沙門氏

5、菌國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株50336、國際標(biāo)準(zhǔn)株994的fimA基因缺失株，并在實(shí)驗(yàn)室保存的SEF14菌毛亞單位缺失株50336ΔsefA、994ΔsefA的基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙缺失突變株ΔsefAΔfimA2株。上述缺失株的成功構(gòu)建，為進(jìn)一步深入研究SEF21、SEF14菌毛在腸炎沙門氏菌感染過程中的獨(dú)立或協(xié)同作用，及如何有效控制腸炎沙門氏菌污染禽蛋產(chǎn)品奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　 2SEF21與SEF14菌毛在腸炎沙門氏菌致病過程中作用初探

6、　　 為了進(jìn)一步研究SEF21和SEF14菌毛對腸炎沙門氏菌致病性的影響，我們將表達(dá)sefA基因的pBR322質(zhì)粒和表達(dá)fimA基因的pACYC184質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的單基因或雙基因缺失株，構(gòu)建了互補(bǔ)株?；谝吧?0336、994，缺失株XΔsefA、XΔfimA、XΔsefAΔfimA及相應(yīng)互補(bǔ)株的基礎(chǔ)上，分別進(jìn)行了人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2的粘附作用，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)及腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)存活試驗(yàn)。各野生株、缺失株和相應(yīng)回補(bǔ)株于

7、CFA培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)48-50h，使SEF21、SEF14菌毛充分表達(dá)，以感染復(fù)數(shù)為100的細(xì)菌懸液感染Caco-2細(xì)胞，細(xì)菌與細(xì)胞共孵育1h，試驗(yàn)結(jié)果表明，XΔsefA、XΔfimA單缺失株與野生株在粘附數(shù)量上差異不顯著，但XΔsefAΔfimA雙缺失株的粘附數(shù)量則明顯下降。同等條件下進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)和存活試驗(yàn)，選取感染1h和4h為時間點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著時間的增加，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對所有野生株、突變株和回補(bǔ)株的吞噬作

8、用加強(qiáng)，且對XΔfimA和XΔsefAΔfimA的吞噬作用尤為顯著，但與X△sefA不同，其在活化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力降低。上述結(jié)果可能意味著腸炎沙門氏菌與腸上皮細(xì)胞的粘附作用盡管受某一特定因子的單一作用影響，但需要多種菌毛結(jié)構(gòu)或粘附因子的共同作用。SEF14菌毛與SEF21菌毛都可能影響腸炎沙門氏菌與巨噬細(xì)胞的相互作用，兩者的存在更有利于腸炎沙門氏菌侵入巨噬細(xì)胞并在巨噬細(xì)胞內(nèi)生長繁殖，導(dǎo)致宿主隱性感染和長期排毒。
　　

9、 3腸炎沙門氏菌及其菌毛突變株對Balb/c小鼠的感染試驗(yàn)將6周齡Balb/c小鼠分成一個對照組和7個攻毒組，經(jīng)腹腔注射途徑分別對各攻毒組試驗(yàn)小鼠接種10、102、103cfu劑量的腸炎沙門氏菌50336和突變株50336ΔsefA、50336ΔfimA、50336ΔsefAΔfimA及相應(yīng)互補(bǔ)株，觀察攻毒后試驗(yàn)組小鼠的臨床變化和死亡情況，對死亡小鼠進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定。測定半數(shù)致死量結(jié)果顯示腸炎沙門氏菌50336和突變株50336Δsef

10、A、50336ΔfimA、50336ΔsefAΔfimA及相應(yīng)互補(bǔ)株對6周齡Balb/c小鼠的LDs0分別為10.50cfu，8.06cfu，14.38cfu，16.77cfu，11.90cfu，11.90cfu，10cfu，說明SEF21菌毛與SEF14菌毛對腸炎沙門氏菌致病力的影響不一，突變株50336ΔsefA增強(qiáng)腸炎沙門氏菌對Balb/c小鼠的毒力，而突變株50336ΔfimA則減弱腸炎沙門氏菌毒力，雙突變株50336ΔsefA

11、ΔfimA毒力降低的原因可能是由于其對腸上皮細(xì)胞的粘附能力下降同時又易被巨噬細(xì)胞清除有關(guān)。腸炎沙門氏菌及其突變株感染小鼠后，細(xì)菌侵害多個臟器，分布廣泛，細(xì)菌鑒定結(jié)果表明，小鼠肝、腎、脾、肺、盲腸及小腸中都可成功分離到攻毒菌株。根據(jù)腸炎沙門氏菌以及相應(yīng)菌毛突變株對Balb/c小鼠的感染試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了腸炎沙門氏菌不同菌毛結(jié)構(gòu)對其致病性的影響，SEF21菌毛可能在腸炎沙門氏菌抵抗易感宿主巨噬細(xì)胞殺傷作用方面起到關(guān)鍵作用，而在SEF14菌毛