基于SEF14菌毛的腸炎沙門(mén)氏菌特異性診斷方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、沙門(mén)氏菌屬于腸桿菌科細(xì)菌，由此類(lèi)細(xì)菌引起的各種動(dòng)物疾病稱為沙門(mén)氏菌病。目前，沙門(mén)氏菌污染禽蛋肉產(chǎn)品已成為嚴(yán)重的全球性食品安全問(wèn)題，其主要病原為腸炎沙門(mén)氏菌。SEF14菌毛特異性表達(dá)于腸炎沙門(mén)氏菌和都柏林沙門(mén)氏菌等D-群沙門(mén)氏菌中，而都柏林沙門(mén)氏菌屬于偏嗜性沙門(mén)氏菌，臨床感染較少。因此，本試驗(yàn)以SEF14菌毛為研究對(duì)象，通過(guò)優(yōu)化SEF14菌毛表達(dá)條件和制備抗SEF14菌毛的單克隆抗體，以期建立腸炎沙門(mén)氏菌特異性診斷方法，為臨床診斷奠定基礎(chǔ)

2、。
　　 研究一:設(shè)計(jì)4種不同的方法表達(dá)SEF14菌毛，通過(guò)勻漿抽提菌毛進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)和透射電鏡觀察菌毛的表達(dá)，以期篩選出腸炎沙門(mén)氏菌SEF14菌毛最優(yōu)表達(dá)條件。結(jié)果顯示方法4的表達(dá)條件最優(yōu)，電鏡下可觀察到SEF14菌毛，且同等條件下的菌毛抽提量最多，即接種腸炎沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株50336于TSB培養(yǎng)基中，25℃搖床培養(yǎng)24h，次日按1:100轉(zhuǎn)接到新的TSB培養(yǎng)基中，20℃搖床培養(yǎng)24h，第三天按1:50轉(zhuǎn)接到CFA(p

3、H6.0)培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)50-60h。按上述方法培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)株50336，用抗SEF14菌毛單克隆抗體和膠體金標(biāo)記的羊抗小鼠IgG分別孵育進(jìn)行免疫電鏡，結(jié)果顯示在菌毛表面吸附有膠體金顆粒，進(jìn)一步表明成功表達(dá)出SEF14菌毛。此外，在SEF14菌毛最優(yōu)表達(dá)條件下，采用勻漿抽提法提取SEF14菌毛蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示從腸炎沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株50336中成功抽提出大小為14.3KD的蛋白，與相關(guān)報(bào)道一致，Western-blott

4、ing結(jié)果進(jìn)一步表明上述蛋白抽提物能被抗SEF14單克隆抗體識(shí)別，為SEF14菌毛。
　　 研究二:將表達(dá)SEF14菌毛的腸炎沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株50336用甲醛滅活，免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，用勻漿抽提的SEF14菌毛蛋白作為檢測(cè)原進(jìn)行間接ELISA篩選，得到3株分泌性能穩(wěn)定的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3E4、3E7和3H5，腹水抗體效價(jià)分別為1:128000、1:64000、1:64000。Wester

5、n-blotting特異性檢測(cè)結(jié)果顯示3株單克隆抗體均能與勻漿抽提的SEF14菌毛蛋白、腸炎沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)株50336和都柏林沙門(mén)氏菌C79-84發(fā)生免疫反應(yīng)，在14.3KD處出現(xiàn)特異性的條帶，而與其他4株沙門(mén)氏菌和3株大腸桿菌均不發(fā)生反應(yīng)，說(shuō)明本試驗(yàn)得到的單克隆抗體具有良好的特異性。
　　 研究三:本試驗(yàn)利用制備的抗SEF14菌毛單克隆抗體建立了一種腸炎沙門(mén)氏菌特異性診斷方法，即SEF14蛋白介導(dǎo)的雙抗體夾心間接ELISA方法(