哈氏弧菌(Vibrio harveyi)谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)與耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、哈氏弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟動物的條件致病菌，大量使用抗生素控制弧菌病導(dǎo)致弧菌的耐藥性和耐藥菌數(shù)目日益增多，使弧菌病的控制變得更加困難，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。關(guān)于致病菌耐藥機制的研究發(fā)現(xiàn)，抗生素作用于致病菌時會引起細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，從而損傷或殺死細胞，因此抗氧化系統(tǒng)通過對ROS的清除成為一種致病菌耐藥形成的非經(jīng)典機制。
　　本研究以哈氏弧菌ZJ0603基因組DNA為模板，通過同源引物克隆、分析了哈氏弧菌gs、gcs和gr基因。

2、結(jié)果表明，gs基因有951 bp的ORF，編碼316個aa，預(yù)測其相對分子量為35.19kDa; gcs基因有1335bp的ORF，編碼444個aa，預(yù)測其相對分子量為50.37kDa; gr基因有1356bp的ORF，編碼451個aa，預(yù)測其相對分子量為48.90kDa; Blast分析發(fā)現(xiàn)哈氏弧菌gs、gcs和gr基因與副溶血弧菌同源性分別為99％、91％和98％，與溶藻弧菌分別為98％、90％和98％。
　　分別構(gòu)建了三個基

3、因的原核表達載體pET-gs，pET-gcs和pET-gr，并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功誘導(dǎo)表達。在最佳表達條件下測定三株重組菌對強力霉素和諾氟沙星的藥物敏感性變化，結(jié)果表明重組菌對強力霉素的耐藥性增強。
　　利用藥敏試驗和試管二倍稀釋法篩選出分別對兩種抗生素具有抗性的耐藥菌，運用RT-PCR技術(shù)，分析了敏感菌和耐藥菌中GSH抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因的相對表達量。結(jié)果顯示，各基因在耐藥菌中的表達量顯著高于敏感菌。
　　采用

4、分光光度法分別測定敏感菌和耐藥菌GSH抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶的活性和GSH含量，結(jié)果表明同一菌株在篩選前和篩選后的酶活性和GSH含量具有顯著差異，即耐藥菌的酶活性和GSH含量顯著高于敏感菌。敏感菌和耐藥菌在抗生素的刺激下OH·含量和酶活性均發(fā)生顯著變化，且敏感菌的OH·含量和酶活性增加倍數(shù)高于耐藥菌，表明抗生素刺激引起細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，耐藥菌不容易受到氧化損害。
　　通過胞外添加GSH或GCS抑制劑BSO后比較不同細菌藥物敏感性的變化，