小鼠角膜上皮祖細(xì)胞的抗氧化性與ROS系統(tǒng)相關(guān)性的研究.pdf

1、目的:活性氧(ROS)是體內(nèi)產(chǎn)生的一種高活性分子，低濃度可以調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，基因轉(zhuǎn)錄和磷酸酶的活性，高濃度則會(huì)導(dǎo)致氧化損傷。目前，有關(guān)干細(xì)胞自身特性的研究越來越受到學(xué)者們的重視，但既往文獻(xiàn)中關(guān)于干細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)以及應(yīng)激條件下細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶活性的變化規(guī)律卻很少報(bào)道。本課題聚焦于，在過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下，活性氧生成關(guān)鍵因子NOX4和抗氧化酶核轉(zhuǎn)錄因子NRF2在小鼠角膜上皮祖細(xì)胞(TKE2)和成熟的小鼠角膜上皮細(xì)胞(MCE

2、)中的不同作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:利用小鼠角膜上皮祖細(xì)胞（TKE2）和成熟小鼠角膜上皮細(xì)胞(MCE)建立過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型。首先我們通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)、免疫熒光染色法、免疫印跡和mRNA基因芯片檢測技術(shù)比較了幾種不同的類干細(xì)胞標(biāo)志物在這兩種細(xì)胞中的表達(dá)性差異。通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測H2O2對(duì)這兩種細(xì)胞的活性影響。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，采用免疫熒光染色和免疫印跡的方法分

3、別檢測兩種細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物3-硝基酪氨酸(3-NT)的含量，并檢測細(xì)胞內(nèi)ROS清除劑超氧化物歧化酶(SOD)的活性。在機(jī)制研究方面，利用熒光定量PCR(qRT-PCR)、免疫熒光染色和免疫印跡方法檢測了ROS重要生成酶NADPH氧化酶4(NOX4)、雙向特異性磷酸酯酶6(DUSP6)和核轉(zhuǎn)錄因子NRF2的表達(dá)水平，同時(shí)，也檢測了基礎(chǔ)狀態(tài)下，NOX4和NRF2在兩種不同細(xì)胞中的含量表達(dá)差異。此外，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)和藥理NOX4激動(dòng)劑

4、—佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯(TPA)來佐證H2O2條件下細(xì)胞中ROS關(guān)鍵因子的變化情況。
　　結(jié)果:細(xì)胞鑒定結(jié)果表明，TKE2細(xì)胞的三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2(ABCG2)、神經(jīng)性鈣粘附素(N-cadherin)等類干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平明顯高于MCE細(xì)胞，且基因PAX6（類細(xì)胞分化標(biāo)志物）含量顯著低于MCE細(xì)胞。隨著H2O2濃度的增高，TKE2細(xì)胞的細(xì)胞活性持續(xù)維持在較高水平，而其對(duì)MCE細(xì)胞的細(xì)胞活性則具

5、有明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性。在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下，TKE2細(xì)胞中ROS水平下降、3-NT表達(dá)含量減少，但SOD活性增強(qiáng);而在MCE細(xì)胞中，ROS水平和3-NT表達(dá)含量增強(qiáng)，而SOD活性降低。H2O2下調(diào)TKE2細(xì)胞中ROS重要生成酶NOX4的水平，升高DUSP6的含量，顯著提高NRF2的表達(dá)水平，并在加入激動(dòng)劑TPA時(shí)，NOX4表達(dá)量明顯上升;而在MCE細(xì)胞中，H2O2則上調(diào)ROS重要生成酶NOX4的水平，降低DUSP6

6、和NRF2的表達(dá)量，且在轉(zhuǎn)入小分子干擾RNA時(shí)NOX4水平顯著下調(diào)。
　　結(jié)論:經(jīng)驗(yàn)證，小鼠角膜上皮祖細(xì)胞(TKE2)較成熟小鼠角膜上皮細(xì)胞(MCE)而言具有干細(xì)胞特性。和MCE細(xì)胞相比，TKE2細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激特性;其作用機(jī)制是抑制ROS氧化產(chǎn)物的生成，下調(diào)ROS重要生成酶NOX4的表達(dá)，激活抗氧化應(yīng)答并上調(diào)ROS清除劑超氧化物歧化酶SOD的表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠角膜上皮祖細(xì)胞(TKE2)呈現(xiàn)出不同的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和抗氧