小鼠角膜上皮祖細胞的抗氧化性與ROS系統(tǒng)相關性的研究.pdf

1、目的:活性氧(ROS)是體內產生的一種高活性分子，低濃度可以調節(jié)細胞代謝，基因轉錄和磷酸酶的活性，高濃度則會導致氧化損傷。目前，有關干細胞自身特性的研究越來越受到學者們的重視，但既往文獻中關于干細胞對氧化應激反應以及應激條件下細胞內相關酶活性的變化規(guī)律卻很少報道。本課題聚焦于，在過氧化氫(H2O2)誘導的氧化應激條件下，活性氧生成關鍵因子NOX4和抗氧化酶核轉錄因子NRF2在小鼠角膜上皮祖細胞(TKE2)和成熟的小鼠角膜上皮細胞(MCE

2、)中的不同作用及相關機制。
　　方法:利用小鼠角膜上皮祖細胞（TKE2）和成熟小鼠角膜上皮細胞(MCE)建立過氧化氫(H2O2)誘導的氧化應激細胞模型。首先我們通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、免疫熒光染色法、免疫印跡和mRNA基因芯片檢測技術比較了幾種不同的類干細胞標志物在這兩種細胞中的表達性差異。通過CCK8實驗檢測H2O2對這兩種細胞的活性影響。通過流式細胞術檢測細胞內的ROS水平，采用免疫熒光染色和免疫印跡的方法分

3、別檢測兩種細胞內氧化應激標志物3-硝基酪氨酸(3-NT)的含量，并檢測細胞內ROS清除劑超氧化物歧化酶(SOD)的活性。在機制研究方面，利用熒光定量PCR(qRT-PCR)、免疫熒光染色和免疫印跡方法檢測了ROS重要生成酶NADPH氧化酶4(NOX4)、雙向特異性磷酸酯酶6(DUSP6)和核轉錄因子NRF2的表達水平，同時，也檢測了基礎狀態(tài)下，NOX4和NRF2在兩種不同細胞中的含量表達差異。此外，應用RNA干擾技術和藥理NOX4激動劑

4、—佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯(TPA)來佐證H2O2條件下細胞中ROS關鍵因子的變化情況。
　　結果:細胞鑒定結果表明，TKE2細胞的三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2(ABCG2)、神經性鈣粘附素(N-cadherin)等類干細胞標志物的表達水平明顯高于MCE細胞，且基因PAX6（類細胞分化標志物）含量顯著低于MCE細胞。隨著H2O2濃度的增高，TKE2細胞的細胞活性持續(xù)維持在較高水平，而其對MCE細胞的細胞活性則具

5、有明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性。在H2O2誘導的氧化應激條件下，TKE2細胞中ROS水平下降、3-NT表達含量減少，但SOD活性增強;而在MCE細胞中，ROS水平和3-NT表達含量增強，而SOD活性降低。H2O2下調TKE2細胞中ROS重要生成酶NOX4的水平，升高DUSP6的含量，顯著提高NRF2的表達水平，并在加入激動劑TPA時，NOX4表達量明顯上升;而在MCE細胞中，H2O2則上調ROS重要生成酶NOX4的水平，降低DUSP6

6、和NRF2的表達量，且在轉入小分子干擾RNA時NOX4水平顯著下調。
　　結論:經驗證，小鼠角膜上皮祖細胞(TKE2)較成熟小鼠角膜上皮細胞(MCE)而言具有干細胞特性。和MCE細胞相比，TKE2細胞具有較強的抗氧化應激特性;其作用機制是抑制ROS氧化產物的生成，下調ROS重要生成酶NOX4的表達，激活抗氧化應答并上調ROS清除劑超氧化物歧化酶SOD的表達水平。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠角膜上皮祖細胞(TKE2)呈現(xiàn)出不同的細胞內穩(wěn)態(tài)和抗氧