MiR-429與卵巢上皮癌耐藥相關性的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一章 miRNA與卵巢上皮癌耐藥研究進展
　　卵巢上皮癌是在全世界婦女中致死率第五位的最常見的婦科惡性腫瘤。手術及以紫杉醇和順鉑為主的化療是治療卵巢上皮癌重要手段之一，但多藥耐藥的產生又是導致化療失敗的關鍵因素。因此，了解化療耐藥產生的機制對于提高治療效果至關重要。卵巢上皮癌多藥耐藥與多種因素有關，本章節(jié)就miRNA與卵巢上皮癌多藥耐藥機制進行綜述。
　　第二章 miRNA對卵巢

2、上皮癌多藥耐藥相關的生物信息學分析
　　1.研究目的:
　　基于表達譜芯片數(shù)據分析和生物信息學手段挖掘與卵巢癌上皮耐藥調控相關的潛在miRNAs和基因。
　　2.研究方法:
　　在Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據庫中下載與卵巢癌耐藥相關的miRNA表達譜芯片數(shù)據GS54665和mRNA表達譜芯片數(shù)據GSE33482，GSE28646，GSE15372，并利用GEO2R工具進行差異分析和

3、篩選，并通過實時定量PCR對其獲得的部分基因在卵巢癌順鉑耐藥細胞SKOV3/DDP和A2780/DDP及其親本細胞中進行驗證。通過通路富集、生物學過程注釋、文本挖掘、蛋白互作及miRNA-mRNA互作等綜合生物信息學方法研究差異表達miRNAs和基因與卵巢癌耐藥調控的相關性。
　　3.研究結果:
　　3.1 在GEO數(shù)據庫獲得了符合標準的與卵巢癌耐藥相關的1組miRNA表達譜芯片數(shù)據和3組mRNA表達譜芯片數(shù)據，獲得了在耐藥

4、細胞中差異表達的9個miRNAs和在三組芯片耐藥細胞中均差異表達的38個基因，其中7個差異表達基因在三組芯片中趨勢完全一致。
　　3.2 9個miRNAs的通路富集獲得了Focal adhesion、PI3K-Akt signalingpathway、ErbB signaling pathway，MAPK signaling pathway等多個與卵巢癌耐藥相關的信號通路有關，而生物學過程注釋和通路富集表明上述38個基因與細胞因子

5、-細胞因子受體作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)通路，細胞黏附及免疫調節(jié)等卵巢癌耐藥生物學過程顯著相關
　　3.3 miRNA-mRNA互作分析表明9個miRNAs與38個基因中的大多數(shù)成員存在靶向調控關系，從而從整體上說明本研究中篩選的差異表達miRNAs和基因與卵巢癌耐藥調控的相關性。
　　4.研究結論:
　　4.1 通過對芯片數(shù)據分析，篩選出9個miRNA及38個

6、mRNA與卵巢癌耐藥有關，其中7個mRNA在所有芯片結果中表達趨勢一致。
　　4.2 EPHA7和PI15為差異表達miRNA-141的潛在靶基因，且它們在表達水平上呈負相關，可能共同參與卵巢癌耐藥，是卵巢癌靶向治療的潛在靶標
　　第三章 卵巢上皮癌多藥耐藥相關lncRNA表達譜分析及與miRNA相關的ceRNA篩選
　　化療是晚期卵巢上皮癌的首選治療方法，但是耐藥的產生是妨礙化療長期有效的一個重要的因素。近年來，人們

7、把研究的目光投向了長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)。長鏈非編碼RNA是一類由RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成，轉錄本長度超過200nt的RNA分子，通常具有polyA尾，廣泛分布于哺乳動物體內。由于缺少“開放閱讀框架”，lncRNA不編碼蛋白，其可在表觀遺傳學，轉錄水平和轉錄后水平等多個層面調控基因表達。但是現(xiàn)在與耐藥相關的lncRNA及與miRNA存在ceRNA調控的lncRNA還鮮有報道。
　　1.

8、研究目的:
　　對卵巢癌多藥耐藥相關lncRNA和基因進行表達譜分析，初步得到卵巢癌多藥耐藥相關lncRNA及基因，為闡明卵巢癌耐藥機制和獲得具有克服耐藥潛能的靶分子打下基礎。
　　2.研究方法:
　　2.1 通過lncRNA芯片對卵巢癌上皮癌耐藥組織標本5例及敏感組織各5例進行l(wèi)ncRNA表達譜分析，同時分析差異表達的mRNA，找到在耐藥細胞中差異表達的lncRNA;
　　2.2 對差異表達的lncRNA采用P

9、earson相關分析進行共表達基因分析、然后利用超幾何累積分布函數(shù)(Hypergeometric cumulative distributionfunction)按FDR＜0.01，P＜0.05，對編碼基因的進行功能注釋。
　　2.3 通過ceRNA_score原理進行ceRNA分析，并通過調控的mRNA進行GO、KEGG功能注釋;并篩選與miR-200家族相關的ceRNA。
　　3.研究結果:
　　3.1 根據差異表

10、達的標準:Fold change值≥2.0且p≤0.05，耐藥組和對敏感組相比，有738個lncRNAs表達有差異，其中上調311個，下調427個，其中NONHSAT076042(Fold change:8.95)是上調倍數(shù)最大的lncRNA，TCONS_12_00021133(Fold change:7.29)是下調倍數(shù)最大的lncRNA;同時檢測到有983個mRNAs表達有差異，其中上調678個，下調308個，其中SFRP2(Fol

11、d change:28.48)是上調倍數(shù)最大的mRNA，LDLRAD1(Foldchange:16.44)是下調倍數(shù)最大的mRNA。
　　3.2 采用Pearson相關分析，按照LncRNAs與mRNAs表達值的相關系數(shù)(Correlation)＞0.7，p＜0.05對差異表達lncRNA進行共表達基因分析，選出上調、下調lncRNA各top300，然后分別進行功能富集，篩選出預測到的功能terms top500，結果顯示上調表達

12、的lncRNA主要與白細胞遷移、細胞外基質、DNA包裝、細胞黏附通路、ECM-受體通路等有關(p＜0.05);下調表達的lncRNA主要細胞外基質組成、細胞骨架、DNA包裝、細胞黏附通路、ECM-受體通路等有關(p＜0.05)。
　　3.3 通過ceRNA分析，得到25個可以作為ceRNA的lncRNA，一共是335個ceRNA關系對，其中，我們也發(fā)現(xiàn)有5個lncRNA可以作為miR-200家族相關的ceRNA，形成ceRNA調控

13、關系對13個。參與ceRNA調控的lncRNA主要參與的生物學過程及KEGG通路有:細胞黏附、NF-kappaB負調控、間質細胞的增殖、凋亡、Ras信號通路、ErbB信號通路等。
　　4.研究結論:
　　4.1 通過分析卵巢上皮癌耐藥組織和敏感的lncRNA和mRNA表達譜特征我們獲得了大量差異表達的lncRNA及mRNA，為我們進行卵巢上皮癌多藥耐藥機制研究提供了很好的資源
　　4.2 與卵巢上皮癌耐藥有關的lncR

14、NA可能是通過cis調控相鄰的基因、trans調控的轉錄因子作用于靶基因，或通過ceRNA調控miRNA，或者通過參與和調控多種信號通路和生物學過程參與卵巢上皮癌耐藥。
　　4.3 5個lncRNA(NONHSAT059750、NONHSAT129265、NONHSAT128169、ENST00000529924、TCONS_12_00003421)與miR-429及其靶基因構成ceRNA調控網絡。
　　第四章 miR-42

15、9對卵巢上皮性癌SKOV3/DDP細胞的生物學功能的體外研究
　　1.研究目的:
　　卵巢上皮癌是婦科腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤，耐藥的產生是腫瘤治療過程中最嚴重的問題之一。腫瘤耐藥與多種因素有關，miRNA可能與耐藥密切相關。miR-429屬于miR-200家族，miR-200家族與多種腫瘤耐藥有關。本章我們將通過體外實驗驗證miR-429對卵巢癌SKOV3/DDP細胞生物學功能的影響。
　　2.研究方法:
　

16、　我們利用慢病毒表達載體成功構建穩(wěn)定上調miR-429的EOC細胞模型，QRT-PCR檢測miR-429的表達水平，CCK8法檢測IC50、生長曲線和平板集落形成實驗檢測細胞增殖能力、流式細胞術檢測細胞凋亡，采用WB檢測miR-429對自噬相關蛋白的影響。
　　3.研究結果:
　　3.1 與親本細胞SKOV3相比，miR-429在耐藥細胞SKOV3/DDP中下調表達，卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP對化療藥物順鉑的IC50約

17、為親本細胞的2.5倍。
　　3.2 在SKOV3/DDP中轉染了LV-miR-429過表達病毒，miR-429的表達量較SKOV3/DDP及LV-miR-NC組，明顯升高（P＜0.05）。過表達miR-429后，SKOV3/DDP對順鉑的IC50明顯下降（P＜0.05）。
　　3.3 CCK8增殖結果:轉染了miR-429的SKOV3/DDP細胞組的生長速度從第48h開始較miR-NC組、空白對照組的細胞降低，差別有統(tǒng)計學意