樺褐孔菌菌核形成關(guān)鍵酶漆酶基因的克隆與序列分析.pdf

1、樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是一種十分珍稀的藥用真菌，其主要藥用部位為菌核。為從分子水平研究菌核形成機(jī)制，以期為其工廠化栽培提供理論依據(jù)，本文作為前期研究克隆了包括9株樺褐孔菌菌株與2株同屬菌株在內(nèi)的共11株纖孔菌屬真菌的漆酶編碼基因的DNA片段，同時(shí)克隆了菌株 FL的漆酶基因cDNA片段，確定了內(nèi)含子位置并推導(dǎo)出氨基酸序列，進(jìn)一步對(duì)所得所有序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果如下：
　　1.采用改良CTAB法提取了1

2、1個(gè)真菌菌株的高質(zhì)量基因組DNA，隨后以其為模板，通過(guò)漆酶保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物Cu1F和Cu2R，PCR擴(kuò)增得到11個(gè)菌株的一共18個(gè)250 bp左右的漆酶編碼基因序列。
　　2.在液體培養(yǎng)下條件下經(jīng)3,5-二羥基甲苯和鄰苯二胺誘導(dǎo)的菌株 FL菌絲體，采用TRIzol法提取其總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以其為模板通過(guò)簡(jiǎn)并引物Cu1F和Cu2R擴(kuò)增得到FL菌株漆酶基因的2個(gè)cDNA序列，大小分別為142 bp和148 bp。

3、
　　3.比對(duì)得到的各菌株DNA序列與FL菌株的cDNA序列，結(jié)果表明各菌株的漆酶基因DNA序列均含有2個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子位置保守。比對(duì)結(jié)果同時(shí)將相似度很高的基因序列分為兩個(gè)組，命名為L(zhǎng)ac1和Lac2，其余相似度較低的序列以“菌株名稱”加“Lac”或“Lac_Un”進(jìn)行命名，這些基因?qū)儆谕换蚣易?。此外，Lac1與Lac2中分別有多個(gè)菌株序列達(dá)到完全一致。
　　4.根據(jù)扣除內(nèi)含子的各序列推導(dǎo)氨基酸序列，結(jié)果表明除NBRC9

4、788編碼46個(gè)氨基酸外，其余每個(gè)序列均可編碼47個(gè)氨基酸。比對(duì)氨基酸序列，可以看到兩端的保守序列，該保守區(qū)含有與銅離子結(jié)合的三個(gè)組氨酸（His/H）。Lac1及Lac2所對(duì)應(yīng)氨基酸序列在組內(nèi)高度一致，表現(xiàn)出了該基因表達(dá)水平上的保守。
　　5.分別基于DNA序列與推導(dǎo)的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化NJ樹(shù)，結(jié)果顯示ELS菌株與其他菌株有相對(duì)較遠(yuǎn)的遺傳關(guān)系，同時(shí)結(jié)合菌株中各個(gè)漆酶家族基因出現(xiàn)與否——ELS菌株未出現(xiàn)Lac1或Lac2，表明E