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文檔簡介
1、隨著現(xiàn)代飼養(yǎng)業(yè)集約化程度的不斷提高,氧化在商品豬生產(chǎn)中的危害已大量顯現(xiàn),可負(fù)面影響活體動(dòng)物的免疫機(jī)能和宰后肉質(zhì)特性等??寡趸缚删徑饣蛘咭种谱杂苫呢?fù)面效應(yīng),提高商品豬的抗氧化能力,進(jìn)而改善商品豬的肉質(zhì)。CuZnSOD(Copper ZincSuperoxide Dismutase)是超氧化物歧化酶(SODs)家族的成員之一,是集體防御氧化損傷的一種重要的金屬酶,能轉(zhuǎn)移性地清除超氧陰離子自由基,在維持氧自由基平衡方面起著重要的作用。
2、r> 為了進(jìn)一步了解和認(rèn)識CuZnSOD基因的結(jié)構(gòu)和功能,揭示CuZnSOD 對豬抗氧化機(jī)能的影響,尋找與肉質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。本研究采用RACE(Rapid Amplificationof cDNA End)和Genome Walking的方法,對萊蕪豬CuZnSOD基因cDNA和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行克隆測序,分析基因結(jié)構(gòu)和功能,并構(gòu)建能在細(xì)胞中表達(dá)的真核表達(dá)載體。用QRT-PCR 檢測CuZnSOD基因的品種和組織差異表達(dá),研究
3、其表達(dá)對肉質(zhì)性狀和肉質(zhì)抗氧化的影響。本研究主要分以下三個(gè)部分:
1.CuZnSOD基因cDNA序列全長658 bp(GenBank 登錄號:GU944822),包含76 bp的5′ UTR和120 bp的3′ UTR序列。全部CDS序列462 bp,編碼153個(gè)氨基酸,分子量為15.9 kDa,等電點(diǎn)PI 為6.03。采用Genome Walking 試劑盒擴(kuò)增基因組的啟動(dòng)子序列,擴(kuò)增得到1876bp的片段。CuZnSOD
4、基因編碼的氨基酸序列中,第3 氨基酸殘基處存在1個(gè)O-糖基化位點(diǎn),第86 氨基酸殘基處存在1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。二級結(jié)構(gòu)中α螺旋僅占1.31%。在進(jìn)化過程中高度保守,與人、牛、小鼠和大鼠的編碼區(qū)同源性分別為87.74%、87.66%、83.44%和83.23%;氨基酸序列同源性分別為90.26%、94.12%、92.21%和91.50%?;诘鞍仔蛄兴鶚?gòu)建的分子進(jìn)化樹,表明豬與牛的親緣關(guān)系最近。
2.采用RT-PCR 方法,
5、以萊蕪豬肌肉總RNA 為模板擴(kuò)增CuZnSOD基因的全長cDNA 編碼區(qū)序列,采用TA 克隆技術(shù),將目的片段插入到pUCm-T 載體中進(jìn)行鑒定,重組的質(zhì)粒命名為pUCm-T-CuZnSOD。隨后將CuZnSOD 進(jìn)一步克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中。用脂質(zhì)體將經(jīng)過測序、驗(yàn)證的重組pcDNA3.1(+)/CuZnSOD 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到山羊毛囊外根鞘細(xì)胞中,用QRT-PCR 檢測CuZnSOD基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果:成功構(gòu)建了pc
6、DNA3.1(+)/CuZnSOD 真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染山羊毛囊外根鞘細(xì)胞,QRT-PCR檢測結(jié)果表明,所轉(zhuǎn)染的CuZnSOD 在山羊毛囊外根鞘細(xì)胞中成功表達(dá)。成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/CuZnSOD,為進(jìn)一步研究CuZnSOD 在肉質(zhì)抗氧化的作用中奠定了基礎(chǔ)。
3.在mRNA 水平上,CuZnSOD是一個(gè)廣譜表達(dá)基因,在大腦、心臟、脾臟、肝臟、腎臟、肺、大腸、小腸、脊髓、肌肉、背膘和胃中都能檢測到,同一個(gè)
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