豬CuZnSOD基因的克隆、mRNA表達(dá)及其對(duì)肉質(zhì)抗氧化性能的影響.pdf

1、隨著現(xiàn)代飼養(yǎng)業(yè)集約化程度的不斷提高，氧化在商品豬生產(chǎn)中的危害已大量顯現(xiàn)，可負(fù)面影響活體動(dòng)物的免疫機(jī)能和宰后肉質(zhì)特性等?？寡趸缚删徑饣蛘咭种谱杂苫呢?fù)面效應(yīng)，提高商品豬的抗氧化能力,進(jìn)而改善商品豬的肉質(zhì)。CuZnSOD(Copper ZincSuperoxide Dismutase)是超氧化物歧化酶(SODs)家族的成員之一，是集體防御氧化損傷的一種重要的金屬酶，能轉(zhuǎn)移性地清除超氧陰離子自由基，在維持氧自由基平衡方面起著重要的作用。

2、r>　　 為了進(jìn)一步了解和認(rèn)識(shí)CuZnSOD基因的結(jié)構(gòu)和功能，揭示CuZnSOD 對(duì)豬抗氧化機(jī)能的影響，尋找與肉質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。本研究采用RACE(Rapid Amplificationof cDNA End)和Genome Walking的方法，對(duì)萊蕪豬CuZnSOD基因cDNA和啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行克隆測(cè)序，分析基因結(jié)構(gòu)和功能，并構(gòu)建能在細(xì)胞中表達(dá)的真核表達(dá)載體。用QRT-PCR 檢測(cè)CuZnSOD基因的品種和組織差異表達(dá)，研究

3、其表達(dá)對(duì)肉質(zhì)性狀和肉質(zhì)抗氧化的影響。本研究主要分以下三個(gè)部分：
　　 1.CuZnSOD基因cDNA序列全長(zhǎng)658 bp(GenBank 登錄號(hào)：GU944822)，包含76 bp的5′ UTR和120 bp的3′ UTR序列。全部CDS序列462 bp，編碼153個(gè)氨基酸，分子量為15.9 kDa，等電點(diǎn)PI 為6.03。采用Genome Walking 試劑盒擴(kuò)增基因組的啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增得到1876bp的片段。CuZnSOD

4、基因編碼的氨基酸序列中，第3 氨基酸殘基處存在1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，第86 氨基酸殘基處存在1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋僅占1.31％。在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，與人、牛、小鼠和大鼠的編碼區(qū)同源性分別為87.74％、87.66％、83.44％和83.23％；氨基酸序列同源性分別為90.26％、94.12％、92.21％和91.50％?；诘鞍仔蛄兴鶚?gòu)建的分子進(jìn)化樹(shù)，表明豬與牛的親緣關(guān)系最近。
　　 2.采用RT-PCR 方法，

5、以萊蕪豬肌肉總RNA 為模板擴(kuò)增CuZnSOD基因的全長(zhǎng)cDNA 編碼區(qū)序列，采用TA 克隆技術(shù)，將目的片段插入到pUCm-T 載體中進(jìn)行鑒定，重組的質(zhì)粒命名為pUCm-T-CuZnSOD。隨后將CuZnSOD 進(jìn)一步克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中。用脂質(zhì)體將經(jīng)過(guò)測(cè)序、驗(yàn)證的重組pcDNA3.1(+)/CuZnSOD 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到山羊毛囊外根鞘細(xì)胞中，用QRT-PCR 檢測(cè)CuZnSOD基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果：成功構(gòu)建了pc

6、DNA3.1(+)/CuZnSOD 真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染山羊毛囊外根鞘細(xì)胞，QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，所轉(zhuǎn)染的CuZnSOD 在山羊毛囊外根鞘細(xì)胞中成功表達(dá)。成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/CuZnSOD，為進(jìn)一步研究CuZnSOD 在肉質(zhì)抗氧化的作用中奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.在mRNA 水平上，CuZnSOD是一個(gè)廣譜表達(dá)基因，在大腦、心臟、脾臟、肝臟、腎臟、肺、大腸、小腸、脊髓、肌肉、背膘和胃中都能檢測(cè)到，同一個(gè)