豬CuZnSOD基因的克隆、mRNA表達及其對肉質抗氧化性能的影響.pdf

1、隨著現(xiàn)代飼養(yǎng)業(yè)集約化程度的不斷提高，氧化在商品豬生產中的危害已大量顯現(xiàn)，可負面影響活體動物的免疫機能和宰后肉質特性等。抗氧化酶可緩解或者抑制自由基的負面效應，提高商品豬的抗氧化能力,進而改善商品豬的肉質。CuZnSOD(Copper ZincSuperoxide Dismutase)是超氧化物歧化酶(SODs)家族的成員之一，是集體防御氧化損傷的一種重要的金屬酶，能轉移性地清除超氧陰離子自由基，在維持氧自由基平衡方面起著重要的作用。

2、r>　　 為了進一步了解和認識CuZnSOD基因的結構和功能，揭示CuZnSOD 對豬抗氧化機能的影響，尋找與肉質性狀相關聯(lián)的分子標記。本研究采用RACE(Rapid Amplificationof cDNA End)和Genome Walking的方法，對萊蕪豬CuZnSOD基因cDNA和啟動子區(qū)域進行克隆測序，分析基因結構和功能，并構建能在細胞中表達的真核表達載體。用QRT-PCR 檢測CuZnSOD基因的品種和組織差異表達，研究

3、其表達對肉質性狀和肉質抗氧化的影響。本研究主要分以下三個部分：
　　 1.CuZnSOD基因cDNA序列全長658 bp(GenBank 登錄號：GU944822)，包含76 bp的5′ UTR和120 bp的3′ UTR序列。全部CDS序列462 bp，編碼153個氨基酸，分子量為15.9 kDa，等電點PI 為6.03。采用Genome Walking 試劑盒擴增基因組的啟動子序列，擴增得到1876bp的片段。CuZnSOD

4、基因編碼的氨基酸序列中，第3 氨基酸殘基處存在1個O-糖基化位點，第86 氨基酸殘基處存在1個N-糖基化位點。二級結構中α螺旋僅占1.31％。在進化過程中高度保守，與人、牛、小鼠和大鼠的編碼區(qū)同源性分別為87.74％、87.66％、83.44％和83.23％；氨基酸序列同源性分別為90.26％、94.12％、92.21％和91.50％?；诘鞍仔蛄兴鶚嫿ǖ姆肿舆M化樹，表明豬與牛的親緣關系最近。
　　 2.采用RT-PCR 方法，

5、以萊蕪豬肌肉總RNA 為模板擴增CuZnSOD基因的全長cDNA 編碼區(qū)序列，采用TA 克隆技術，將目的片段插入到pUCm-T 載體中進行鑒定，重組的質粒命名為pUCm-T-CuZnSOD。隨后將CuZnSOD 進一步克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)中。用脂質體將經過測序、驗證的重組pcDNA3.1(+)/CuZnSOD 質粒轉染到山羊毛囊外根鞘細胞中，用QRT-PCR 檢測CuZnSOD基因mRNA的表達。結果：成功構建了pc

6、DNA3.1(+)/CuZnSOD 真核表達質粒，轉染山羊毛囊外根鞘細胞，QRT-PCR檢測結果表明，所轉染的CuZnSOD 在山羊毛囊外根鞘細胞中成功表達。成功構建真核表達質粒pcDNA3.1(+)/CuZnSOD，為進一步研究CuZnSOD 在肉質抗氧化的作用中奠定了基礎。
　　 3.在mRNA 水平上，CuZnSOD是一個廣譜表達基因，在大腦、心臟、脾臟、肝臟、腎臟、肺、大腸、小腸、脊髓、肌肉、背膘和胃中都能檢測到，同一個