MDV CVI988弱毒疫苗株VP22蛋白轉導功能研究.pdf

1、血清Ⅰ型馬立克氏病病毒(Marek'sdiseasevirusserotype1，MDV-1)的UL49h基因與Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)UL49同源，編碼病毒被膜蛋白VP22，分子量約27.6kD，是病毒被膜的主要成分?，F已證實，MDV-1VP22對病毒的復制和傳播有著非常重要的作用。Dorange等發(fā)現MDV-1VP22具有與HSV-1相似的蛋白轉導功能。Hung等研究發(fā)現MDV-1VP22能增強人16型乳頭狀瘤病毒(HPV-1

2、6)E7抗原融合表達的免疫效果，主要產生CD8+T細胞介導的細胞免疫應答。 本研究利用無致病性的CVI988/Rispens疫苗株擴增VP22基因，結果發(fā)現其C端缺失6個氨基酸，即201TKSERT206，對CVI988VP22蛋白轉導功能的研究結果提示：CVI988VP22可作為一種高效便捷的蛋白轉運工具，對于彌補DNA免疫缺陷和提高治療性物質的轉導效率具有非常重要的意義。 1不同致病型馬立克氏病病毒VP22蛋白的序列

3、比較和分析 用MDV-1CVI988/Rispens株、GA株、RB1B株和648A株，MDV-2Z4株和FC126株分別感染鴨胚成纖維細胞或雞胚成纖維細胞，待出現大量空斑時，提取總DNA。根據已發(fā)表的MDVGA株VP22序列設計引物，成功擴增出MDV-1不同毒株的VP22基因。將PCR產物克隆T載體并測序分析，結果發(fā)現：強毒株GA株、超強毒RB1B株和特超強毒648A株的VP22長度保持750bp，但CVI988弱毒株的VP2

4、2基因C端缺失18bp，即存在一個6氨基酸殘基的缺失性突變：201TKSERT206。 2CVI988弱毒疫苗株VP22羧基端原核表達及特異性抗體的制備 設計特異性引物，擴增全長VP22、CVI988VP22的羧基端區(qū)域(VP22C：aa94～243)、VP22末端區(qū)(VP22T：aa207～249)、缺失N端的VP22(VP22H：aa19～243)。將BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切PCR產物，克隆入pGEX-6P-1載

5、體中，轉化BL21(DE3)細菌，經IPTG誘導表達，結果發(fā)現：VP22C獲得了高效可溶性表達。SDS-PAGE分離陽性條帶，采用切膠免疫或用誘導后的細菌經超聲波裂解的細菌上清混合弗氏佐劑免疫小鼠后，制得抗VP22陽性血清。用該抗體檢測感染MDV-1的CEF中VP22的表達，結果發(fā)現：VP22最早在感染后3h即可向所有細胞核中擴散；利用雜交瘤技術研制出5株抗VP22的特異性單克隆抗體，命名為3F7、4E4、4A10、2E1和2E10。免

6、疫學特性鑒定結果顯示：這些單抗至少針對兩種不同抗原表位，單抗3F7能指示胞漿中的VP22及與變性VP22蛋白反應；而單抗4E4則與COS-1真核表達和細胞核內VP22反應。這些抗體的成功制備為深入研究VP22蛋白轉導功能提供了必要的生物材料。 3MDV-1VP22在真核系統中的表達和鑒定 設計特異性引物，PCR擴增VP22M(aa94-193)、VP22S(aa19-193)和VP22N(aa1-193)，將這些PCR產

7、物、不同毒株(GA、648A和CVI988株)VP22、VP22C、VP22T、VP22H分別克隆入pFAST-Bac1轉移載體中，通過與DH10BAC轉座后，挑取經過篩選的白色菌落提取重組桿狀病毒DNA，轉染Sf9昆蟲細胞，在BAC-to-BAC系統中表達這些目的基因。結果成功構建了VP22全長及多種缺失片段重組桿狀病毒，分別命名為：Bac-VP22、Bac-VP22C(aa94-243)、Bac-VP22M(aa94-193)、Ba

8、c-VP22T(aa207-249)、Bac-VP22H(aa19-243)、Bac-VP22S(aa19-193)和Bac-VP22N(aa1-193)。利用VP22單抗和多抗對這些突變體進行鑒定，結果發(fā)現：單抗3F7具有IFA和Western-blot效價，能與Bac-VP22M感染的細胞反應，但不能與Bac-VP22T反應；而單抗4E4能與在COS-1細胞中暫態(tài)表達的VP22M反應，也不能與VP22T反應。這些現象說明這兩株單抗雖

9、然可能均針對VP22M，但免疫學特性完全不同。這為下一步深入研究VP22不同區(qū)域的功能和細胞攝入試驗提供了修飾完整的天然抗原 4CVI988VP22蛋白轉導功能的研究 為了進一步證實MDV-1VP22蛋白轉導功能和效率，本研究通過將所有上述不同缺失型的VP22與EGFP相融合，轉染COS-1細胞，通過間接免疫熒光方法，檢測VP22的蛋白轉導現象。結果發(fā)現，EGFP-VP22具有微管結合、核膜結合、核酸結合、蛋白轉導等特性

10、；然而，GAVP22更傾向于結合細胞內膜。IFA分析發(fā)現：CVI988VP22與GA株VP22的轉導效率相當，且只有完整長度的VP22具有最高效的攜帶目的蛋白轉導的功能。細胞攝入試驗發(fā)現：各種表達的VP22均具有轉導效應，且單獨表達的VP22C亦具有細胞間轉導功能，但其不能攜帶EGFP在細胞間轉導。研究結果表明，N1-18(1MGDSERRKSERRRSLGYP18)具有潛在的核定位特性，對VP22轉導功能的發(fā)揮意義很大；VP22T(C

11、207-249)影響VP22的胞漿定位及蛋白轉導效率。因此，N1-18和C207-249作為VP22細胞間轉導的輔助區(qū)域，對其轉導功能的發(fā)揮具有重要意義。這一發(fā)現為利用CVI988VP22攜帶其他目的蛋白轉導，增強目的蛋白免疫原性及其治療性功能具有重要的指導價值。 5VP22轉導目的蛋白譜的初步篩選 VP22并不能攜帶所有蛋白質在細胞間轉導，本研究選取禽流感病毒(AIV)NP基因、牛IFN-γ(BIFN-γ)、雞傳染性法

12、氏囊病病毒(IBDV)VP2基因、雞傳染性貧血病毒(CIAV)VP3基因與VP22基因進行融合表達，在COS-1中進行暫態(tài)表達。IFA檢測結果發(fā)現：與VP22融合的CIAVVP3在胞漿中呈不可溶的團塊；與VP22融合的IBDVVP2，仍定位于胞漿中，且N端融合或C端融合的轉染結果相似，證明VP2并沒有被VP22轉導入所有細胞中；與VP22融合的EGFP蛋白、BIFN-γ和AIVNP蛋白則具有高效的轉導效果，均定位于所有細胞核。這為VP2

13、2轉導功能與免疫增強作用之間的關系研究奠定了基礎。 6CVI988VP22增強IBDVVP2基因免疫效果的評價 將IBDVVP2與CVI988VP22基因插入pcDNA3.1構建融合蛋白表達載體，在COS-1細胞中進行暫態(tài)表達。結果表明：VP22并不能促進VP2向周圍未轉染細胞擴散，VP22和VP2均散在于胞漿中，即VP22對VP2沒有明顯的蛋白轉導作用，VP2反而影響VP22在細胞內的正常定位。通過小鼠股四頭肌免疫注射

14、多聚乙烯基亞胺(PEI)包裹的裸質粒DNA(w/w=2∶1)進行DNA免疫，以間接ELISA測定VP2抗體效價，FACS檢測T細胞亞類結果發(fā)現，雖然VP22并沒有明顯促進VP2的體液免疫應答，利用紅細胞裂解液裂解獲得的淋巴細胞分群沒有明顯區(qū)別，但利用淋巴細胞分離液分離的脾細胞經分群后發(fā)現：VP22-VP2質粒免疫組和VP2質粒免疫組的CD3+T細胞數量明顯高于EGFP-VP2組和對照組(P＜0.05)，VP22-VP2免疫組小鼠CD8+