MDV CVI988弱毒疫苗株VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能研究.pdf

1、血清Ⅰ型馬立克氏病病毒(Marek'sdiseasevirusserotype1，MDV-1)的UL49h基因與Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)UL49同源，編碼病毒被膜蛋白VP22，分子量約27.6kD，是病毒被膜的主要成分。現(xiàn)已證實(shí)，MDV-1VP22對病毒的復(fù)制和傳播有著非常重要的作用。Dorange等發(fā)現(xiàn)MDV-1VP22具有與HSV-1相似的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。Hung等研究發(fā)現(xiàn)MDV-1VP22能增強(qiáng)人16型乳頭狀瘤病毒(HPV-1

2、6)E7抗原融合表達(dá)的免疫效果，主要產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。 本研究利用無致病性的CVI988/Rispens疫苗株擴(kuò)增VP22基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其C端缺失6個(gè)氨基酸，即201TKSERT206，對CVI988VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的研究結(jié)果提示：CVI988VP22可作為一種高效便捷的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)工具，對于彌補(bǔ)DNA免疫缺陷和提高治療性物質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率具有非常重要的意義。 1不同致病型馬立克氏病病毒VP22蛋白的序列

3、比較和分析 用MDV-1CVI988/Rispens株、GA株、RB1B株和648A株，MDV-2Z4株和FC126株分別感染鴨胚成纖維細(xì)胞或雞胚成纖維細(xì)胞，待出現(xiàn)大量空斑時(shí)，提取總DNA。根據(jù)已發(fā)表的MDVGA株VP22序列設(shè)計(jì)引物，成功擴(kuò)增出MDV-1不同毒株的VP22基因。將PCR產(chǎn)物克隆T載體并測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：強(qiáng)毒株GA株、超強(qiáng)毒RB1B株和特超強(qiáng)毒648A株的VP22長度保持750bp，但CVI988弱毒株的VP2

4、2基因C端缺失18bp，即存在一個(gè)6氨基酸殘基的缺失性突變：201TKSERT206。 2CVI988弱毒疫苗株VP22羧基端原核表達(dá)及特異性抗體的制備 設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增全長VP22、CVI988VP22的羧基端區(qū)域(VP22C：aa94～243)、VP22末端區(qū)(VP22T：aa207～249)、缺失N端的VP22(VP22H：aa19～243)。將BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物，克隆入pGEX-6P-1載

5、體中，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)細(xì)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：VP22C獲得了高效可溶性表達(dá)。SDS-PAGE分離陽性條帶，采用切膠免疫或用誘導(dǎo)后的細(xì)菌經(jīng)超聲波裂解的細(xì)菌上清混合弗氏佐劑免疫小鼠后，制得抗VP22陽性血清。用該抗體檢測感染MDV-1的CEF中VP22的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：VP22最早在感染后3h即可向所有細(xì)胞核中擴(kuò)散；利用雜交瘤技術(shù)研制出5株抗VP22的特異性單克隆抗體，命名為3F7、4E4、4A10、2E1和2E10。免

6、疫學(xué)特性鑒定結(jié)果顯示：這些單抗至少針對兩種不同抗原表位，單抗3F7能指示胞漿中的VP22及與變性VP22蛋白反應(yīng)；而單抗4E4則與COS-1真核表達(dá)和細(xì)胞核內(nèi)VP22反應(yīng)。這些抗體的成功制備為深入研究VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能提供了必要的生物材料。 3MDV-1VP22在真核系統(tǒng)中的表達(dá)和鑒定 設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增VP22M(aa94-193)、VP22S(aa19-193)和VP22N(aa1-193)，將這些PCR產(chǎn)

7、物、不同毒株(GA、648A和CVI988株)VP22、VP22C、VP22T、VP22H分別克隆入pFAST-Bac1轉(zhuǎn)移載體中，通過與DH10BAC轉(zhuǎn)座后，挑取經(jīng)過篩選的白色菌落提取重組桿狀病毒DNA，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，在BAC-to-BAC系統(tǒng)中表達(dá)這些目的基因。結(jié)果成功構(gòu)建了VP22全長及多種缺失片段重組桿狀病毒，分別命名為：Bac-VP22、Bac-VP22C(aa94-243)、Bac-VP22M(aa94-193)、Ba

8、c-VP22T(aa207-249)、Bac-VP22H(aa19-243)、Bac-VP22S(aa19-193)和Bac-VP22N(aa1-193)。利用VP22單抗和多抗對這些突變體進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：單抗3F7具有IFA和Western-blot效價(jià)，能與Bac-VP22M感染的細(xì)胞反應(yīng)，但不能與Bac-VP22T反應(yīng)；而單抗4E4能與在COS-1細(xì)胞中暫態(tài)表達(dá)的VP22M反應(yīng)，也不能與VP22T反應(yīng)。這些現(xiàn)象說明這兩株單抗雖

9、然可能均針對VP22M，但免疫學(xué)特性完全不同。這為下一步深入研究VP22不同區(qū)域的功能和細(xì)胞攝入試驗(yàn)提供了修飾完整的天然抗原 4CVI988VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的研究 為了進(jìn)一步證實(shí)MDV-1VP22蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能和效率，本研究通過將所有上述不同缺失型的VP22與EGFP相融合，轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，通過間接免疫熒光方法，檢測VP22的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGFP-VP22具有微管結(jié)合、核膜結(jié)合、核酸結(jié)合、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)等特性

10、；然而，GAVP22更傾向于結(jié)合細(xì)胞內(nèi)膜。IFA分析發(fā)現(xiàn)：CVI988VP22與GA株VP22的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相當(dāng)，且只有完整長度的VP22具有最高效的攜帶目的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。細(xì)胞攝入試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：各種表達(dá)的VP22均具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)，且單獨(dú)表達(dá)的VP22C亦具有細(xì)胞間轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，但其不能攜帶EGFP在細(xì)胞間轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究結(jié)果表明，N1-18(1MGDSERRKSERRRSLGYP18)具有潛在的核定位特性，對VP22轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的發(fā)揮意義很大；VP22T(C

11、207-249)影響VP22的胞漿定位及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。因此，N1-18和C207-249作為VP22細(xì)胞間轉(zhuǎn)導(dǎo)的輔助區(qū)域，對其轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的發(fā)揮具有重要意義。這一發(fā)現(xiàn)為利用CVI988VP22攜帶其他目的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)，增強(qiáng)目的蛋白免疫原性及其治療性功能具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。 5VP22轉(zhuǎn)導(dǎo)目的蛋白譜的初步篩選 VP22并不能攜帶所有蛋白質(zhì)在細(xì)胞間轉(zhuǎn)導(dǎo)，本研究選取禽流感病毒(AIV)NP基因、牛IFN-γ(BIFN-γ)、雞傳染性法

12、氏囊病病毒(IBDV)VP2基因、雞傳染性貧血病毒(CIAV)VP3基因與VP22基因進(jìn)行融合表達(dá)，在COS-1中進(jìn)行暫態(tài)表達(dá)。IFA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與VP22融合的CIAVVP3在胞漿中呈不可溶的團(tuán)塊；與VP22融合的IBDVVP2，仍定位于胞漿中，且N端融合或C端融合的轉(zhuǎn)染結(jié)果相似，證明VP2并沒有被VP22轉(zhuǎn)導(dǎo)入所有細(xì)胞中；與VP22融合的EGFP蛋白、BIFN-γ和AIVNP蛋白則具有高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，均定位于所有細(xì)胞核。這為VP2

13、2轉(zhuǎn)導(dǎo)功能與免疫增強(qiáng)作用之間的關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ)。 6CVI988VP22增強(qiáng)IBDVVP2基因免疫效果的評價(jià) 將IBDVVP2與CVI988VP22基因插入pcDNA3.1構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體，在COS-1細(xì)胞中進(jìn)行暫態(tài)表達(dá)。結(jié)果表明：VP22并不能促進(jìn)VP2向周圍未轉(zhuǎn)染細(xì)胞擴(kuò)散，VP22和VP2均散在于胞漿中，即VP22對VP2沒有明顯的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，VP2反而影響VP22在細(xì)胞內(nèi)的正常定位。通過小鼠股四頭肌免疫注射

14、多聚乙烯基亞胺(PEI)包裹的裸質(zhì)粒DNA(w/w=2∶1)進(jìn)行DNA免疫，以間接ELISA測定VP2抗體效價(jià)，F(xiàn)ACS檢測T細(xì)胞亞類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然VP22并沒有明顯促進(jìn)VP2的體液免疫應(yīng)答，利用紅細(xì)胞裂解液裂解獲得的淋巴細(xì)胞分群沒有明顯區(qū)別，但利用淋巴細(xì)胞分離液分離的脾細(xì)胞經(jīng)分群后發(fā)現(xiàn)：VP22-VP2質(zhì)粒免疫組和VP2質(zhì)粒免疫組的CD3+T細(xì)胞數(shù)量明顯高于EGFP-VP2組和對照組(P＜0.05)，VP22-VP2免疫組小鼠CD8+