原生質(zhì)體融合技術(shù)及其在微生物育種中的應(yīng)用【文獻(xiàn)綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　食品科學(xué)與工程</b></p><p>　　原生質(zhì)體融合技術(shù)及其在微生物育種中的應(yīng)用</p><p>　　摘　要：原生質(zhì)體融合技術(shù)是微生物遺傳育種上的一項(xiàng)重要技術(shù),它具有遺傳信息傳遞量大,不受親緣關(guān)系的影響,可有目的地選擇親株以選育理想的融

2、合株,便于操作等優(yōu)點(diǎn),在菌種選育中具有廣闊的應(yīng)用前景.本文從原生質(zhì)體的制備及其影響因素、原生質(zhì)體融合的促融方法、原生質(zhì)體融合子的篩選以及融合技術(shù)在微生物菌種選育中的應(yīng)用等方面進(jìn)行了綜述.</p><p>　　關(guān)鍵詞：原生質(zhì)體融合;菌種選育;生物技術(shù);應(yīng)用</p><p><b>　　1.前言</b></p><p>　　原生質(zhì)體融合育種(pro

3、toplast fusion)是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來的基因重組技術(shù)。通過兩個(gè)遺傳性狀不同的親株原生質(zhì)體融合從而達(dá)到雜交目的。1960年法國的Ilarsi研究小組在培養(yǎng)兩種不同動(dòng)物細(xì)胞混合時(shí)發(fā)現(xiàn)了自發(fā)融合現(xiàn)象，同時(shí)日本的Dkada發(fā)現(xiàn)仙臺病毒可誘發(fā)內(nèi)艾氏腹水病細(xì)胞彼此融合，從而開始了細(xì)胞融合的探索。1974年匈牙利的Fereezyt采用離心力誘導(dǎo)的方法實(shí)現(xiàn)了白地霉(Creotrichumcandidum)營養(yǎng)缺陷型突變株原生質(zhì)體的融合

4、；隨后人們相繼用NaCl、KCl和Ca(NO，)：等作為誘變劑進(jìn)行融合，但融合率比較低；1978年國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會提出了原生質(zhì)體的融合問題，使這一技術(shù)迅速擴(kuò)展到了育種領(lǐng)域；1979年匈牙利的Pesti首先提出了運(yùn)用融合育種技術(shù)提高青霉素的產(chǎn)量的報(bào)告，從而開創(chuàng)了原生質(zhì)體融合技術(shù)在工業(yè)微生物育種實(shí)際工作中的應(yīng)用。 </p><p>　　從此，原生質(zhì)體融合育種廣泛應(yīng)用于霉菌、酵母菌、放線菌和細(xì)菌，并從株內(nèi)、株

5、間發(fā)展到種內(nèi)、種間，打破種屬間親緣關(guān)系，實(shí)現(xiàn)屬間、門間，甚至跨界融合。</p><p>　　2.原生質(zhì)體融合技術(shù)</p><p>　　原生質(zhì)體的制備與再生技術(shù)  微生物細(xì)胞一般是有細(xì)胞壁的，進(jìn)行該項(xiàng)技術(shù)的第一步就是制備原生質(zhì)體。當(dāng)前去除細(xì)胞壁的方法主要有機(jī)械法、非酶法和酶法。采用前兩種方法制備的原生質(zhì)體效果差，活性低，僅適用于某些特定菌株，因此，并未得到推廣。在實(shí)際工作中，最有效

6、和最常用的是酶法。該法時(shí)間短，效果好。使用的酶主要為蝸牛酶或溶菌酶，具體根據(jù)所用微生物的種類而定。影響原生質(zhì)體形成的因素很多，不同的微生物有其較為適當(dāng)?shù)男纬蓷l件。在菌齡選擇上，多采用對數(shù)生長期或生長中后期的菌，也有的采用生長后期的，這主要是由于對數(shù)生長期細(xì)菌的壁中肽聚糖含量最低，細(xì)胞壁對酶的作用最敏感，但是對數(shù)生長早期的菌相對較為脆弱，受酶的過度作用會影響原生質(zhì)體的再生率。彭智華等對野生大杯蕈(Clitocybe maxima)進(jìn)行原生

7、質(zhì)體制備的過程中，用2種以上的酶液混合使用能提高去壁效果。陳海昌等證明，在一定范圍內(nèi)，酶作用的時(shí)間、酶作用的濃度都與原生質(zhì)體的形成率成正相關(guān)，而與再生率成反相關(guān)。林紅雨等采用酶解10min后補(bǔ)加EDTA的方法，改變酶解環(huán)境中的離子強(qiáng)度和滲透壓，可以提高原生質(zhì)體形成率。Coster- on J．w．等(1967)</p><p>　　2．2原生質(zhì)體融合的促融方法  由于在自然條件下，原生質(zhì)體發(fā)生融合的頻率

8、非常低，所以在實(shí)際育種過程中要采用一定的方法進(jìn)行人為地促融合。當(dāng)前常用的方法主要有：化學(xué)法、物理法和生物法等。這幾種方法各有其自身的特點(diǎn)，在進(jìn)行實(shí)際工作中可根據(jù)操作對象選擇適合的融合方法。</p><p>　　2．3遺傳標(biāo)記的選擇與融合子的檢出假設(shè)用于原生質(zhì)體融合實(shí)驗(yàn)兩親本的基因型分別為A和B型，那么經(jīng)誘導(dǎo)融合，整個(gè)群體中含有五種類型：A，AA，AB，BB，B。其中只有AB型才有可能形成真正的雜種細(xì)胞，而其余四種

9、類型必須淘汰。所以考慮采用一種行之有效的篩選方法是原生質(zhì)體融合實(shí)驗(yàn)里至關(guān)緊要的一環(huán)。下面介紹幾種常用的篩選方法。</p><p>　　2．3．1 利用營養(yǎng)缺陷型作為遺傳標(biāo)記選擇融合子即融合的雙親為營養(yǎng)缺陷型，并且為不同的缺陷型。雙親缺陷的原生質(zhì)體融合后于基本培養(yǎng)基上選擇融合子，缺陷的單親原生質(zhì)體由于喪失了合成某種物質(zhì)的能力，在基本培養(yǎng)基上不能萌發(fā)生長，單親融合的原生質(zhì)體也不能長出菌落，雙親原生質(zhì)體融合后

10、，缺陷的遺傳物質(zhì)得到互補(bǔ)可以恢復(fù)為野生型，在基本培養(yǎng)基上能夠萌發(fā)生長成為菌落。</p><p>　　2．3．2利用抗藥性作為遺傳標(biāo)記選擇融合子微生物的抗藥性是其菌種的特性，是由遺傳物質(zhì)決定的。不同種的微生物對某一種藥物的抗性存在差異，利用這種差異或與菌種其它特性結(jié)合起來即可對融合子進(jìn)行選擇。這種方法首先由Bradshaw和Peberdy于1984年使用。藥物的濃度過高會使融合頻率降低，濃度過低則會使親本生長，影響

11、融合子的檢出。</p><p>　　2．3．3  應(yīng)用滅活原生質(zhì)體作為遺傳標(biāo)記選擇融合子原生質(zhì)體經(jīng)紫外線照射、加熱或經(jīng)某些化學(xué)藥劑的處理，可使其喪失在再生培養(yǎng)基上再生的能力，而只能作為遺傳物質(zhì)的供體。從而只根據(jù)另一親株特性設(shè)計(jì)選擇條件而選擇融合子。周東坡等通過紫外線照射滅活原生質(zhì)體融合選育了啤酒酵母新菌株。用0．1％碘乙酸，30℃處理產(chǎn)阮假絲酵母(Cam／ida utilis)原生質(zhì)體40min后，與啤

12、酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的原生質(zhì)體融合，利用形態(tài)差異選擇融合子。滅活原生質(zhì)體的機(jī)理認(rèn)為是：紫外線使菌株的DNA發(fā)生突變，熱的作用可使細(xì)胞內(nèi)有功能蛋白、酶蛋白變性失活，化學(xué)藥劑的作用能不可逆地抑制細(xì)胞代謝過程的關(guān)鍵酶，使之失活。</p><p>　　3原生質(zhì)體融合技術(shù)在選育微生物中的應(yīng)用</p><p>　　3．1選育優(yōu)良的菌種  原生質(zhì)體融合廣泛

13、應(yīng)用到釀酒酵母的改良。彭幫柱等以釀酒酵母1605和蘋果酒酵母E2為親本，通過原生質(zhì)體融合，得到融合子8#菌株，具有產(chǎn)香能力和發(fā)酵能力均強(qiáng)于雙親的優(yōu)點(diǎn)。黎永學(xué)等以雙歧桿菌和釀酒酵母為親本進(jìn)行融合，得到的融合子具有雙親的生物學(xué)特性，為雙歧桿菌生物學(xué)功能的開發(fā)提供了新思路、新途徑。王憲等利用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得具有雙親殺蟲譜的新菌株。諸如此類的報(bào)道國內(nèi)外均有。</p><p>　　3．2選育抗菌素高產(chǎn)菌株在抗生素的研究

14、中，原生質(zhì)體融合技術(shù)可用于提高抗生素的產(chǎn)量。但是，種間融合獲得的融合子菌株往往會產(chǎn)生一些不希望有的組分。為了解決這一問題，張瑾陽等在進(jìn)行去甲基金霉素產(chǎn)生菌與金霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體融合以選育產(chǎn)去甲基金霉素的菌株時(shí)，對金霉素產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體進(jìn)行熱滅活，減少了既產(chǎn)生金霉素和四環(huán)素又產(chǎn)生去甲基產(chǎn)物的融合子。結(jié)果在所得的融合子中85％以上只產(chǎn)生去甲基產(chǎn)物，從而提高了目的產(chǎn)物的相對產(chǎn)量。</p><p>　　3．3 

15、 改良菌種的遺傳特性  通過原生質(zhì)體融合技術(shù)使兩個(gè)菌株的遺傳物質(zhì)得到重組，從而獲得兼具兩個(gè)親本優(yōu)良性狀的新菌株。如蘇云金桿菌以色列變種(Bacillus thurinensis subsp．israelensis)產(chǎn)生的殺蟲毒素主要?dú)⑺离p翅目昆蟲，而蘇云金桿菌庫斯塔基變種(Bacillus thunn一giensis subsp.kuestaki HD—I)產(chǎn)生的毒素蛋白主要?dú)Ⅶ[翅目昆蟲。將這兩個(gè)菌株的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，篩選得

16、到既殺鱗翅目昆蟲、又殺雙翅目害蟲的重組菌株。3．4原生質(zhì)體融合技術(shù)在污水工程菌構(gòu)建上的應(yīng)用  利用微生物處理及利用污水是一個(gè)很有效的方法，但是這一技術(shù)的應(yīng)用往往涉及多種微生物，多種菌的優(yōu)化組合是一個(gè)很復(fù)雜的課題，原生質(zhì)體融合技術(shù)可以將多個(gè)功能組合到一個(gè)菌上，為其在污水處理上的應(yīng)用提供了良好的條件。許燕濱等采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，將兩株具有含氯有機(jī)化合物降解特性的菌假單胞菌T—l和諾卡氏菌RB—l融合構(gòu)建成一株高效降解含氯有機(jī)化合

17、物工程菌，應(yīng)用于造紙漂白廢水，融合菌去除CODCr和TCL的能力比混合菌分別提高了72．05％和190％。周德明采用原生原體融合技術(shù)</p><p>　　4.原生質(zhì)體融合的前景</p><p>　　原生質(zhì)體融合技術(shù)已經(jīng)在實(shí)踐中取得巨大成就了，已經(jīng)在社會上占據(jù)了重要的地位。它在微生物育種、植物育種、動(dòng)物育種、啤酒酵母原生質(zhì)體融合株、防治蔬菜害蟲方面、防治動(dòng)物疾病方面、乳液發(fā)酵劑方面有了很大的

18、進(jìn)展，它已經(jīng)成為高新技術(shù)開發(fā)的重要領(lǐng)域，如果我們能夠開展多個(gè)菌株之間的融合，則有可能獲得同時(shí)具有多個(gè)優(yōu)良性狀的菌株，進(jìn)一步拓寬這一技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1]Ferencezy L,Kevei F,Zsolt J.Fusion of fungal Protoplast[J].Nature,1974,248

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