利用雙親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行米曲霉育種的研究.pdf

1、米曲霉(Aspergillusoryzae)是釀造業(yè)中的重要微生物，對醬油、豆瓣、米酒等的產(chǎn)率和風(fēng)味起著重要作用。然而生產(chǎn)實(shí)踐中，米曲霉的生產(chǎn)能力常常欠佳，生長較快的菌種往往蛋白酶活力較低，而蛋白酶活力較高的往往生長速度較慢。另外，原生質(zhì)體融合工作在絲狀真菌中已有廣泛開展，但傳統(tǒng)方法中采用的利用營養(yǎng)缺陷標(biāo)記親本菌株一步工作相當(dāng)繁瑣，而且這些遺傳標(biāo)記還往往會干擾菌株的正常代謝，影響菌株的一些重要性狀。由此，本實(shí)驗采用了菌種GIM3.13和

2、CICC2339的滅活原生質(zhì)體作為遺傳物質(zhì)供體進(jìn)行了原生質(zhì)體融合，通過雙親本基因的隨機(jī)整合使融合菌株集雙親優(yōu)良遺傳性狀為一體。整個試驗過程中，首先，對親本米曲霉原生質(zhì)體制備與再生中的破壁酶種類和濃度以及其它影響原生質(zhì)體制備與再生的主要因素進(jìn)行了研究，得到米曲霉原生質(zhì)體制備與再生最佳條件組合為：纖維素酶、溶壁酶、蝸牛酶以5∶3∶1混合作為破壁酶，菌齡為15h，破壁時DTT加入量為3mM，0.8MNaCl溶液作為滲透壓穩(wěn)定劑。其次，是對原生

3、質(zhì)體滅活的研究，本試驗對GIM3.13采用熱滅活的方法，通過試驗得到滅活最佳條件為滅活溫度60℃，滅活時間15min，對CICC2339采用紫外線滅活，通過試驗得到滅活最佳條件為15W紫外燈10cm處，照射5min。然后，對影響米曲霉滅活雙親本的融合主要條件因素進(jìn)行了研究，得到融合佳條件組合為，35％的PEG6000加上0.02MCaCl2作為促融劑，pH值為7.5，融合時間為5分鐘。最后融合子的成功篩選不僅表明滅活原生質(zhì)體融合可應(yīng)用于