滅活原生質(zhì)體融合法在蛹蟲草優(yōu)良菌株選育中的應(yīng)用.pdf

1、蛹蟲草（Cordyceps militaris （L.Fr）Link.）屬子囊菌門（Ascomycota）、核菌綱（Pyrenomycetes）、球殼目（Sphaeriales）、麥角菌科（Clavicipitaceae）、蟲草屬（Cordyceps （Fr.）Link）真菌，可滋補強身、補肺益腎、止咳化痰，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有很高的經(jīng)濟價值。 本研究從全國收集了9個蛹蟲草菌株，編號為1-9號，通過人工培養(yǎng)觀察其農(nóng)藝性狀

2、，采用高效液相法（HPLC）測定菌絲體胞內(nèi)蟲草素、腺苷和尿苷含量，3,5-二硝基水楊酸法（DNS）測定糖含量。研究結(jié)果顯示，4號菌株原基分化早且數(shù)量多，較適合武漢地區(qū)春季栽培，8號菌株表現(xiàn)最優(yōu)，子實體粗壯且生長整齊，蟲草素及胞內(nèi)糖含量顯著高于其它菌株。選定4號菌株和8號菌株作為滅活原生質(zhì)體融合的親本，以便篩選得到原基分化早、子實體粗壯且蟲草素含量高的優(yōu)良子代。 原生質(zhì)體再生試驗和最低致死時間試驗表明，酶解5小時再生率最高，紫外滅

3、活和60℃熱處理的最低致死時間分別為8min和14min。聚乙二醇（PEG）作為融合劑，將滅活的雙親原生質(zhì)體等量混合，融合子因為滅活位點互補可以再生，未融合的親本則不能再生。 用雙層培養(yǎng)法25℃培養(yǎng)4天，隨機挑取再生菌株228個。228個再生菌株菌絲體液體培養(yǎng)20天后，酯酶同工酶電泳篩選具有雙親特異酶帶的再生菌株53個，初步判斷為融合子。HPLC法測定53個再生菌株胞內(nèi)蟲草素等核苷物質(zhì)含量，有36株再生菌株含量與8號親本相近或高

4、于8號親本。采用ISSR引物進行PCR擴增，53個再生菌株中有26個菌株同時具有雙親特有帶，進一步從分子水平表明這26個再生菌株為融合子。 對36個再生菌株人工培養(yǎng)，其中17個菌株長出幼嫩子實體，但原基數(shù)量遠低于雙親。綜合蟲草素含量和人工培養(yǎng)結(jié)果，選出16株進行遺傳穩(wěn)定性的測定。16個再生菌株轉(zhuǎn)管培養(yǎng)4次，測定菌絲體胞內(nèi)蟲草素含量，比較各株每代蟲草素含量差異，考察其遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明，16株中除2株蟲草素含量有下降趨勢外，其余