柳蠶卵黃原蛋白基因的克隆與表達分析.pdf

1、柳蠶是一種尚未開發(fā)的野生絹絲昆蟲，國內(nèi)外對柳蠶的研究并不多，且大部分都是關(guān)于形態(tài)學(xué)和生物習(xí)性方面的報道和記載。柳蠶的卵黃原蛋白是由大小兩個亞基組成，分子量分別是175KDa和45KDa。卵黃原蛋白作為昆蟲卵黃發(fā)生的主要蛋白之一，除了具有營養(yǎng)功能外，在生物體內(nèi)還具有許多其他重要的生物學(xué)功能。近些年來，關(guān)于昆蟲卵黃原蛋白基因的研究是熱點，不斷有蠶卵黃原蛋白的一級結(jié)構(gòu)被解析，但柳蠶卵黃原蛋白全基因序列至今未解析。該研究結(jié)果可為進一步研究卵黃原

2、蛋白在柳蠶中的功能及其應(yīng)用提供參考。
　　 本文根據(jù)已解析的柳蠶卵黃原蛋白cDNA序列和家蠶、天蠶、柞蠶卵黃原蛋白5'端調(diào)控區(qū)的序列，設(shè)計特異性引物，其中有10對引物從柳蠶基因組DNA中擴增出了其卵黃原蛋白基因的10個DNA片段，經(jīng)克隆、測序和分析后獲得了柳蠶卵黃原蛋白的基因序列（GenBank登錄號：GU361974），基因全長7329bp，包含6個外顯子，5個內(nèi)含子以及一段206bp的5’端調(diào)控區(qū)序列，其中外顯子的大小分別為

3、2246bp、205bp、982bp、879bp、184bp和863bp;內(nèi)含子的大小分別為107bp、84bp、626bp、706bp和230bp。與其它己解析的昆蟲卵黃原蛋白基因比較發(fā)現(xiàn)，柳蠶和柞蠶的卵黃原蛋白基因結(jié)構(gòu)更為相似，它們均在起始密碼子ATG后31bp處有一個大的內(nèi)含子缺失。在5'端調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)了BmDsx結(jié)合位點以及CdxA和GATA-X調(diào)控元件。
　　 同時，提取柳蠶雌蠶不同時期和不同組織的總RNA，以M-MLV

4、反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA，以柳蠶18SrRNA基因做內(nèi)參，摸索條件后進行了半定量RT-PCR。實驗結(jié)果顯示，柳蠶卵黃原蛋白基因在5齡第1、4、7、11天時未表達，預(yù)蛹期達到一個相當(dāng)高的水平，隨后又開始下降，直至滯育期其量又稍有上升；且在中腸、頭、馬氏管中不表達，在血液、脂肪體和卵巢中有所表達，但表達量無明顯差異。這說明柳蠶卵黃原蛋白的表達存在明顯的時期和組織的特異性。
　　 PCR法擴增了柳蠶卵黃原蛋白的小亞基，并連接至pET-28