野桑蠶卵黃原蛋白受體的鑒定與表達(dá)分析.pdf

1、野桑蠶(Bombyxmandarina)是屬于鱗翅目的一種野生昆蟲(chóng),又稱(chēng)野蠶。野桑蠶地理分布范圍廣泛,中國(guó)、日本、朝鮮、韓國(guó)等國(guó)家分布較多,俄羅斯和印度亦有少量分布。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)野桑蠶的研究報(bào)道還較少。
　　卵生昆蟲(chóng)在發(fā)育過(guò)程中,卵黃原蛋白受體(vitellogeninreceptor,VgR)通過(guò)胞吞作用介導(dǎo)卵母細(xì)胞對(duì)卵黃蛋白的攝取,從而為卵生昆蟲(chóng)的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。到目前為止,已經(jīng)有15種昆蟲(chóng)的卵黃原蛋白受體的cDNA及基因組

2、序列被測(cè)定,它們都屬于低密度脂蛋白受體家族,具有共同的保守功能域結(jié)構(gòu)。
　　本文通過(guò)已經(jīng)解析的家蠶、柳蠶及其他昆蟲(chóng)的卵黃原蛋白受體的cDNA序列,通過(guò)設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物,經(jīng)PCR法擴(kuò)增,克隆,測(cè)序,拼接獲得野桑蠶卵黃原蛋白受體基因的全長(zhǎng)cDNA序列。該序列全長(zhǎng)5861bp,其中包含一個(gè)154bp的5′端非編碼區(qū),一個(gè)274bp的3′端非編碼區(qū),一個(gè)5433bp的開(kāi)放讀碼框,該序列編碼1811個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白分子量約為202.6k

3、Da。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明野桑蠶VgR氨基酸序列與柳蠶VgR的同源性最高,高達(dá)99.7％。
　　利用ScanProsite在線軟件分析野桑蠶卵黃原蛋白受體(VgR)蛋白功能域,選取其中兩個(gè)配體結(jié)合域進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物連接至質(zhì)粒pET-28a表達(dá)載體,分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-BmaLBD1和pET-28a-BmaLBD2并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),采用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)其原核表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE電泳和免疫

4、印跡分析表明,被誘導(dǎo)的目的蛋白均得到正確表達(dá),重組蛋白分子量大小分別為22.1kDa和44.7kDa。用Ni-NTA親和層析柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化并制備多克隆抗體,獲得的抗體效價(jià)為12800。
　　提取野桑蠶上蔟期的卵巢,脂肪體,馬氏管,表皮,頭,中腸6個(gè)不同組織的總蛋白和總RNA,通過(guò)免疫印跡法和半定量PCR法分析野桑蠶VgR在不同組織中的表達(dá)分布情況。結(jié)果表明野桑蠶VgR只特定在卵巢和脂肪體組織中表達(dá)。
　　根據(jù)半定量PC

5、R結(jié)果提取野桑蠶化蛹后第一天蛹到第七天蛹脂肪體組織的總蛋白和總RNA。通過(guò)熒光定量PCR和免疫印跡法分析野桑蠶VgR在蛹期脂肪體組織的表達(dá)水平,結(jié)果表明野桑蠶VgR在蛹期第三天表達(dá)量最高。
　　野桑蠶是桑樹(shù)的主要葉部害蟲(chóng)之一,同時(shí)鱗翅目昆蟲(chóng)又是農(nóng)業(yè)和森林害蟲(chóng)的主要類(lèi)群,是殺蟲(chóng)劑的主要作用對(duì)象。對(duì)野桑蠶VgR的研究有助于深入了解鱗翅目害蟲(chóng)生殖的分子機(jī)制,為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)探求合理的害蟲(chóng)防治方法提供理論基礎(chǔ),對(duì)防治新途徑以及新一代環(huán)保型農(nóng)藥的