凡納濱對蝦酚氧化酶原基因的克隆及功能研究.pdf

1、本研究通過RACE-PCR技術(shù)將酚氧化酶原．1全長序列克隆出來，發(fā)現(xiàn)與已經(jīng)報道的凡納濱對蝦的序列(命名為proPO-1a)在3'UTR上不同，而且在整個全長上也不同。我們克隆到的酚氧化酶原-1(命名為proPO-1b)全長3232bp，長于proPO—1a，2471bp。Northern blot分析表明，一條清晰的約3.2kb的條帶被檢測到，而在2.5kb位置上則沒有檢測到。序列分析發(fā)現(xiàn)兩個proPO-1在3'UTR上游均有一個微衛(wèi)星

2、序列，proPO-1a的序列為完全型微衛(wèi)星，proPO-1b的序列為復(fù)雜的不完全型微衛(wèi)星。兩個序列在微衛(wèi)星之間基本一致，而在其之后完全不同。我們檢測了來自5個地方的不同凡納濱對蝦群體，發(fā)現(xiàn)沒有檢測到已經(jīng)報道的proPO-1a序列，均為我們報道的proPO-1b序列。本文首次發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦中存在兩種酚氧化酶原基因，也同時是在甲殼動物中首次發(fā)現(xiàn)同一物種存在兩種酚氧化酶原基因。在NCBI的Genbank中只有日本對蝦有兩種不同的酚氧化酶原蛋白

3、序列，但從基因序列比對情況看，除了中間有一段序列不同，其它序列均一致?？梢耘袛嗥鋺?yīng)該是同一個基因編碼的不同酚氧化酶原剪接體。而我們克隆的兩個酚氧化酶原基因雖然在核酸、蛋白序列上有同源性，但它們在整體的cDNA結(jié)構(gòu)上不同，屬于兩個不同的基因，分別命名為酚氧化酶原-1b(LvproPO-1b)和酚氧化酶原-2(LvproPO-2)。LvproPO-1b和LvproPO-2有共同的功能結(jié)構(gòu)域，包括銅離子結(jié)合位點A、銅離子結(jié)合位點B和thiol

4、 ester-like結(jié)構(gòu)。蛋白序列比對表明它們之間有72％相似性。 凡納濱對蝦在WSSV攻毒下，LvproPO-1b和LvproPO-2均呈現(xiàn)下調(diào)的現(xiàn)象，說明WSSV會抑制LvproPO-1b和LvproPO-2在血細胞中的表達。 用pQE載體分別克隆和表達酚氧化酶原-1的一段多肽段和酚氧化酶原-2蛋白，并通過純化，免疫小鼠，已經(jīng)獲得重組蛋白的抗體。經(jīng)過west blotting分析，兩個抗體均達到1：5000以上的抗