化濁行血湯含藥血清血管內(nèi)皮保護(hù)作用及其體內(nèi)給藥時效差異的研究

1、<p>　　化濁行血湯含藥血清血管內(nèi)皮保護(hù)作用及其體內(nèi)給藥時效差異的研究</p><p>　　【摘要】 　　目的觀察化濁行血湯含藥血清對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，以及其藥理作用與動物灌胃給藥的量-時效關(guān)系。方法以化濁行血湯不同給藥方案、藥后不同取血時間所得的藥物血清為受試對象，培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)行缺氧復(fù)氧實(shí)驗(yàn)，復(fù)氧同時給予不同化濁行血湯含藥血清干預(yù)，采用MTT法觀察不同含藥血清對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響

2、。結(jié)果含藥血清各組與模型組比較有顯著差異(P&lt;0.05)。給藥后不同時間取血所獲得的藥物血清對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響存在一定差異，以2次/d灌胃連續(xù)3 d，并在末次灌胃90 min后取血所得藥物血清藥理效應(yīng)最佳。結(jié)論化濁行血湯含藥血清具有保護(hù)缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的作用，其血清藥效與動物給藥方法存在一定時效關(guān)系。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 化濁行血湯； 內(nèi)皮細(xì)胞； 血清藥理學(xué)； MTT法</p

3、><p>　　中藥復(fù)方進(jìn)入體內(nèi)后，不同劑量的藥物其在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄不同，血藥濃度達(dá)峰時間和起效時間亦有較大差異。為研究中藥復(fù)方化濁行血湯對內(nèi)皮缺氧損傷的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法觀察化濁行血湯含藥血清對內(nèi)皮細(xì)胞抗缺氧能力的影響，并據(jù)此篩選出合適的含藥血清濃度用于后續(xù)內(nèi)皮缺氧損傷的研究。</p><p><b>　　1 材料與儀器</b></p>

4、;<p>　　1.1 對象雄性Sprague-dawley大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，購于山東中醫(yī)藥大學(xué)動物中心，符合國家二級實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系（hUVECs，購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，自美國組織培養(yǎng)庫ATTCCCRI－1998引進(jìn)）。</p><p>　　1.2 試劑1640培養(yǎng)基（GIBCO公司產(chǎn)品）、胎牛血清（FBS，Hyclone公司產(chǎn)品）；四氮唑藍(lán)(美國SIGM

5、A)；二甲基亞砜(北京世紀(jì)銀豐科技有限公司)。</p><p>　　1.3 儀器 JJT-1300超凈工作臺（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠）；5%CO2恒溫培養(yǎng)箱（Forma Scientific 公司）；倒置相差顯微鏡（美國AO Sientific Instrument；酶標(biāo)儀）；EL340I 全自動酶標(biāo)儀（美國Biotok公司產(chǎn)品）。</p><p><b>　　2 方法</

6、b></p><p>　　2.1 藥物的配制和含藥血清的制備化濁行血湯由荷葉、焦山楂、決明子、赤芍、酒大黃、路路通、虎杖、何首烏，制水蛭粉組成（全部藥材來源于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院），為水煎醇沉工藝制作浸膏，4℃貯存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　取SD大鼠按8.25 g/kg灌服化濁行血湯。中藥A組大鼠按照每日灌胃兩次連續(xù)3 d，中藥B組大鼠按照灌胃1次/d，連續(xù)5 d，空白組灌服等

7、量生理鹽水，末次給藥前禁食12 h，給藥后30，60，90，150 min腹主動脈取血，分離血清并滅活、過濾除菌，置－20℃保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p>　　2.2 內(nèi)皮細(xì)胞體外缺血、缺氧模型的建立和實(shí)驗(yàn)分組選擇生長良好的內(nèi)皮細(xì)胞，以5×104/ml 密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，分為正常對照組、模型組及藥物（缺氧）各劑量組進(jìn)行缺血、缺氧造模及干預(yù)。 ①正常組：換1640培養(yǎng)基（1640 90%，

8、正常大鼠血清10%），并始終在正常條件下培養(yǎng)。②模型組：以2006年葉武等［1］報告的方法稍加改進(jìn)。缺氧時先將缺氧罐（由干燥皿改裝）提前10 min充入氮?dú)猓魉?.5 L／min），以保證缺氧罐內(nèi)氣體的純度，罐周邊封凡士林密閉，然后置于37℃生化培養(yǎng)箱中，備用。將培養(yǎng)板中內(nèi)皮細(xì)胞換缺氧無血清1640培養(yǎng)基（用前預(yù)先向培養(yǎng)基通入氮?dú)? min）；將其放入缺氧罐內(nèi)。缺氧6h后，將培養(yǎng)液換為含10％正常大鼠血清的1640培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中

9、（空氣+5%CO2）繼續(xù)培養(yǎng)18 h，然后進(jìn)行檢測。③中藥各劑量組：造模同模型組，缺氧6 h后，將培養(yǎng)液換成含10％SD大鼠藥物血清的1640培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中（空氣+5% CO2）繼續(xù)培養(yǎng)18 h，然后進(jìn)行檢測。</p><p>　　2.3 四氮唑藍(lán)(MTT)檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞兩次，各加入1640 100 μl，MTT 15 μl，繼續(xù)置培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100

10、μl，終止反應(yīng)。振蕩器振蕩10 min，全自動酶標(biāo)儀490 nm波長，空白孔調(diào)零，測定各孔吸光度（OD）值。</p><p>　　2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。組內(nèi)差異采用t檢驗(yàn)，組間差異采用多因素方差分析，F(xiàn)檢驗(yàn)(Avon)。</p><p><b>　　3 結(jié)果</b></p><p>　　3.1 各組內(nèi)皮細(xì)胞形

11、態(tài)特征變化鏡下觀察正常組內(nèi)皮細(xì)胞展開貼壁，形態(tài)無明顯改變。體外模擬缺氧6 h后模型組內(nèi)皮細(xì)胞回縮，間隙變大，變圓細(xì)胞增多，常規(guī)培養(yǎng)18 h后大量內(nèi)皮細(xì)胞變圓并呈團(tuán)漂浮，折光性增強(qiáng)。中劑量中藥各組鏡下觀察缺氧并經(jīng)含藥血清干預(yù)后也可見細(xì)胞回縮，部分細(xì)胞變圓并漂浮；但各組仍見貼壁的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量明顯多于模型組，漂浮變圓細(xì)胞明顯少于模型組。</p><p>　　3.2 各組內(nèi)皮細(xì)胞缺血缺氧后細(xì)胞活力的比較（MTT實(shí)驗(yàn)）結(jié)

12、果見表1。表1 10％化濁行血湯含藥血清對缺氧內(nèi)皮細(xì)胞MTT比色實(shí)驗(yàn)的影響（略）</p><p><b>　　4 討論</b></p><p>　　4.1 化濁行血湯含藥血清的對缺氧復(fù)氧內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用王新陸教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，以“血濁”立論，創(chuàng)立清化血濁法治療中風(fēng)，并據(jù)此組方化濁行血湯。化濁行血湯由荷葉、焦山楂、決明子、赤芍、制水蛭、酒軍、路路通、虎杖、

13、何首烏組成。動物實(shí)驗(yàn)研究表明，化濁行血湯能明顯改善MCAO大鼠缺血再灌注后的神經(jīng)功能損傷、減小缺血再灌注腦損傷的體積，該治療作用與其對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)建立血管內(nèi)皮細(xì)胞缺血再灌注模型，利用化濁行血湯含藥血清進(jìn)行干預(yù)，以MTT評價內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷變化。MTT在活細(xì)胞線粒體呼吸鏈上的琥珀酸脫氫酶作用下還原成一種藍(lán)紫色結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。

14、實(shí)驗(yàn)研究證明缺氧復(fù)氧后內(nèi)皮細(xì)胞活力明顯下降并伴有顯著地形態(tài)學(xué)異常，而化濁行血湯含藥血清能顯著提高缺氧復(fù)氧后內(nèi)皮細(xì)胞的活力且形態(tài)學(xué)改變較小。提示該方具有明顯的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。</p><p>　　4.2 化濁行血湯含藥血清藥效與動物體內(nèi)給藥有一定的時效關(guān)系中藥血清藥理學(xué)研究表明，含藥血清的時效主要與動物的給藥時間和取血時間有關(guān)。由于不同中藥復(fù)方成分很大差別，給藥后的峰值出現(xiàn)的時間亦有較大差別。血清中確切的藥

15、效成分并不清楚時，應(yīng)利用藥效為指標(biāo)行“時效關(guān)系”研究，以評判最佳給藥時間和取血時間。嚴(yán)格地說，應(yīng)該根據(jù)藥物半衰期給藥，連續(xù)5～7個半衰期達(dá)到穩(wěn)態(tài)血藥濃度，但由于中藥及其復(fù)方成分復(fù)雜，半衰期很難測定，我們按照化濁行血湯為半衰期12 h設(shè)定每日灌胃兩次連續(xù)3 d給藥方案A，按照化濁行血湯為半衰期12 h設(shè)定每日灌胃1次連續(xù)6 d給藥方案B，結(jié)果表明兩種方案獲得含藥血清無明顯差別。如果對藥物血清時效關(guān)系進(jìn)行研究，應(yīng)另當(dāng)別論。</p>

16、;<p>　　實(shí)驗(yàn)動物學(xué)研究表明，大鼠一般灌喂給藥后1～2 h后血藥濃度達(dá)到峰值，此時的血清為機(jī)體功能狀態(tài)血清，最好能通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定最佳血時間，我們在本研究中設(shè)立了灌喂后30，60，90，150 min 4個采血時間點(diǎn)。結(jié)果表明，化濁行血湯含藥血清血管內(nèi)皮保護(hù)作用與大鼠取血時間有一定的時效關(guān)系，給藥后藥效逐漸增強(qiáng)，灌喂后90 min藥效最明顯，150 mim時藥效已有下降的趨勢，提示灌喂后90 min所得含藥血清藥物濃度

17、最高，具有最佳的藥理效果。</p><p>　　總之，我們的研究表明，化濁行血湯含藥血清對缺氧血管內(nèi)皮細(xì)胞的具有明顯保護(hù)作用，且該藥理作用與動物灌喂后的采血時間有一定時效關(guān)系，據(jù)此我們認(rèn)為按照每日灌胃2次，連續(xù)3 d給藥并在末次灌喂后90 min采血獲得含藥血清具有最明顯的內(nèi)皮保護(hù)作用，這為我們后續(xù)的深入研究打下了基礎(chǔ)。</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b>