用pcr-page切膠回收-pcr測序法制備dxs9898基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物

1、<p>　　用PCR-PAGE切膠回收-PCR測序法制備DXS9898基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物</p><p>　　【摘要】 目的 ：探索一種快速制備X染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的簡便方法。方法 ：采用PCR-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)切膠回收-二次PCR-測序

2、的方法制備X-STR基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。結(jié)果：應(yīng)用此法制備出大量的DXS9898基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。結(jié)論：利用PCR-PAGE切膠回收-PCR測序制備STR基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物是一種簡便易行的方法。 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 聚丙烯酰胺凝膠電泳;切膠回收;DXS9898基因座;等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物</p><p>　　X染色體的STR廣泛分布于真核基因組中，高度穩(wěn)定

3、且有高度多態(tài)性， X-STR的最大應(yīng)用價值就在于可以解決一些特殊的親子鑒定案[1]，如單親父女的親權(quán)鑒定，缺乏雙親認(rèn)定姐妹親權(quán)關(guān)系。X-STR不僅在法醫(yī)學(xué)中有其獨特的應(yīng)用價值，而且是進行X連鎖遺傳病基因診斷和基因定位的重要方法，對于人類學(xué)研究也有重要意義。X-STR基因座的基因型檢測需經(jīng)擴增、與等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物同步電泳才可獲得正確的基因型。我們將PCR、聚丙烯酰胺凝膠電泳、切膠回收PCR產(chǎn)物、再次擴增及直接測序結(jié)合起來，探索了一種簡單

4、、快速制備DXS9898基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的方法。</p><p><b>　　1 材料和方法</b></p><p>　　1.1 DNA樣品 174名漢族無關(guān)女性個體的血液樣本來自溫州地區(qū)，系本實驗室日常檢案積累。血液樣本采用EDTANa2抗凝，Chelex-100快速法[2]提取DNA。</p><p><b>　　1.2

5、方法</b></p><p>　　1.2.1 首次PCR擴增：DXS9898基因座的引物序列參照基因組數(shù)據(jù)庫(www.gdb.org)，由上海生工生物工程公司合成。PCR擴增條件為94 ℃變性3 min，然后94 ℃變性35 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)35次后，72 ℃保持5 min，于4 ℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分型，銀染顯色[3]。</p>

6、<p>　　1.2.2 從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA片段：在凝膠尚未完全干燥時用手術(shù)刀片切取含有目的條帶的凝膠，要使切下的凝膠盡可能的細(xì)，用小鑷子將其移入0.5 mL的離心管內(nèi)，加20μL TE，用小鑷子將凝膠夾碎，放入濕盒內(nèi)，置于60 ℃ 恒溫干燥箱中過夜后，將管子放入PCR儀中95 ℃ 變性10 min，短暫離心后取上清液2μL作為再次PCR擴增的模板。注意切取不同條帶時要將刀片和小鑷子盡可能地清洗干凈，防止DNA交叉污

7、染。</p><p>　　1.2.3 再次PCR擴增和序列測定：用上述DNA模板，使用原引物，建立20μL PCR反應(yīng)體系，按第1次PCR條件完成35個循環(huán)。產(chǎn)物純化后，委托上海盛兆生物科技有限公司用雙脫氧終止法在ABI公司的3730測序儀上測定序列。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 首次PCR的PAG

8、E電泳結(jié)果 在174名溫州漢族無關(guān)女性個體中，DXS9898基因座共檢出5個等位基因，其多態(tài)性片段長度范圍為193～214 bp。挑選含不同等位基因的5個漢族個體的PCR擴增產(chǎn)物與pUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅡ)Marker同步電泳(見圖1)。</p><p>　　2.2 切膠回收與再次PCR結(jié)果 分別切膠回收DXS9898基因座各等位基因(見圖2)，并以回收DNA為模板再次PCR，結(jié)果見圖3。</

9、p><p>　　2.3 再次PCR產(chǎn)物直接測序結(jié)果 取DXS9898基因座兩個等位基因直接測序，測序結(jié)果按照重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)命名為等位基因8.3和等位基因11(見圖4)。</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　目前，PCR-STR分型技術(shù)已成為國內(nèi)外物證鑒定的主流技術(shù)，按照國際DNA委員會的要求，STR基因座的片段長度

10、等位基因命名應(yīng)有等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物作為參照，按重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)命名等位基因和基因型。因此，找到一種簡便易行的方法制備一套精確的、國際標(biāo)準(zhǔn)化命名的標(biāo)準(zhǔn)參照物是非常必要的。</p><p>　　X染色體STR基因座作為常染色體和線粒體等多態(tài)性標(biāo)記的重要補充，對X染色體的STR基因座分型結(jié)果作出正確地判定和命名，X-STR數(shù)據(jù)才能在個各實驗室之間進行交流和合作。制備X染色體STR基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物，目前經(jīng)常采取

11、的方法有兩種:一是混合不同等位基因的擴增產(chǎn)物，再對各等位基因進行測序[4-5]，該法的缺點是不適合大量生產(chǎn)，一旦含有罕見等位基因的模板DNA用完，很難調(diào)配出等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。二是用克隆技術(shù)制備等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物[6]，克隆方法在克隆成功后，可以通過培養(yǎng)細(xì)菌來大量制備等位基因，對保留罕見等位基因比較方便，但因其需要克隆和細(xì)菌培養(yǎng)，操作較復(fù)雜，對技術(shù)和環(huán)境要求也較高。而本方法所使用的儀器設(shè)備簡單，結(jié)果明確，重復(fù)性好，可以獲得經(jīng)典克隆測序一

12、樣的確切序列，而避免了克隆的復(fù)雜后續(xù)過程，且第一次、第二次PCR和測序過程中用的都是統(tǒng)一引物，不需要再合成新的引物，所以該方法可供一般實驗室廣泛使用，但對其的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的研究目前尚處在摸索階段。</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】</b></p><p>　　[1] 呂德堅, 劉秋玲.X染色體STR的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用進展[J].中國法</p><

13、;p>　　醫(yī)學(xué)雜志,2002,17(4):252-255.</p><p>　　[2] Gehrig C, Hochmeister M, Borer UV, et al. Swiss Caucasian</p><p>　　population data for 13 STR loci using AmpFISTR profiler</p><p>　　plu

14、s and cofiler PCR amplification kits[J].J Forensic Sci,</p><p>　　1999,44(5):1035-1038.</p><p>　　[3] 吳淑珍,呂建新,張洪勤. 3個STR基因座在溫州漢族群體中</p><p>　　的遺傳多態(tài)性[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2004,19(2):102-103.</

15、p><p>　　[4] 石美森,應(yīng)斌武,鄧建強,等.成都地區(qū)漢族人群X染色體3個</p><p>　　STR基因座的遺傳多態(tài)性及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用[J].四川大學(xué)學(xué)</p><p>　　報:醫(yī)學(xué)版,2004,35(4):473-476.</p><p>　　[5] 楊昕,廖燦,黃以寧,等.廣東漢族人群21號染色體4個短串聯(lián)</p><