副溶血弧菌：分子分型與主要耐藥基因雙重PCR檢測(cè).pdf

1、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是一種嗜鹽菌,廣泛分布于海洋環(huán)境及海產(chǎn)品中。該菌能引起人類的食物中毒及各種水生動(dòng)物疾病。人類食物中毒的癥狀有腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱,甚至脫水、昏迷等癥狀。耐熱直接溶血素(TDH),耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素(TRH)是公認(rèn)的副溶血弧菌主要毒力因子,它們與副溶血弧菌的致病能力密切相關(guān)。近年來(lái)尿素酶和三型分泌系統(tǒng)的致病力也逐漸受到學(xué)者的重視。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中,副溶血弧菌引起的疾病有

2、牡蠣腸炎,蝦紅腿病,蟹大規(guī)模死亡,大黃魚弧菌病等。目前養(yǎng)殖業(yè)普遍使用抗生素治療水生動(dòng)物弧菌病,過(guò)量和濫用藥物已嚴(yán)重威脅到我國(guó)對(duì)外貿(mào)易,養(yǎng)殖業(yè)和人類健康。本研究研究目的是:
　　(1)對(duì)攜帶tdh,ureC和T3SS2毒力基因的副溶血弧菌環(huán)境株和臨床株進(jìn)行分子分型,為建立一個(gè)可靠的食品污染溯源體系、深入研究副溶血弧菌分子多樣性提供基礎(chǔ);
　　(2)建立能快速檢測(cè)副溶血弧菌主要耐藥基因的PCR方法。為建立副溶血弧菌分子分型與溯源

3、體系,利用多位點(diǎn)序列分型技術(shù)(MLST)對(duì)實(shí)驗(yàn)室2003-2009年分離或保存的71株副溶血弧菌臨床株、環(huán)境株和海產(chǎn)品株進(jìn)行分子分型。
　　結(jié)果表明,7個(gè)看家基因分辨率高,均能達(dá)到良好的分型效果。71株細(xì)菌被歸為62個(gè)STs,這62個(gè)STs與網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)已有的共計(jì)201個(gè)STs被分為4個(gè)克隆群(Clonal Complexes,CC),18個(gè)組(Groups)和141個(gè)單型(Singletons)。其中本實(shí)驗(yàn)室54個(gè)STs為單型,占

4、總單型的38.3％,其余8個(gè)STs分布在2個(gè)克隆群和6個(gè)組中。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果與eBURST結(jié)果基本一致,兩者均證明了副溶血弧菌的分子多態(tài)性。eBURST軟件的分析為追蹤流行菌株及預(yù)測(cè)克隆群始祖提供了有力工具。副溶血弧菌CC3群是國(guó)際上自1996以來(lái)的主要流行菌群,被認(rèn)為是始祖菌。我國(guó)2006-2009年的部分臨床分離株也屬于CC3。在流行性克隆群中,包含了眾多血清型,提示了傳統(tǒng)血清型分型方式的局限性。進(jìn)化樹(shù)分析對(duì)不同STs之間的關(guān)系提供了更

5、多細(xì)節(jié),在114個(gè)STs中的所有菌株形成4個(gè)分枝,其中本實(shí)驗(yàn)室的大部分菌株和國(guó)內(nèi)外的部分代表性菌株在其中的兩個(gè)主要分枝,但有5個(gè)STs(分別代表4個(gè)菌株)則在另兩個(gè)分枝。然而,我們也發(fā)現(xiàn)使用這一MLST分型方法作為食源性疾病發(fā)生時(shí)的溯源有其局限性,需要適當(dāng)考慮毒力基因的序列分析。根據(jù)相關(guān)資料,磺胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類及頭孢類基因?yàn)楦比苎【鷶y帶的主要耐藥基因。為建立一種檢測(cè)副溶血弧菌主要耐藥基因的快速方法,先通過(guò)單一PCR確定陽(yáng)性菌

6、株與引物對(duì),后優(yōu)化PCR體系條件,建立了兩個(gè)雙重PCR體系,分別同時(shí)檢測(cè)磺胺類和氨基糖苷類,四環(huán)素類和頭孢類耐藥基因。特異性試驗(yàn)表明不耐藥菌株中檢測(cè)不出耐藥基因,敏感性試驗(yàn)表明只要陽(yáng)性細(xì)菌模板濃度達(dá)到105CFU/mL以上,即可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。應(yīng)用該體系對(duì)寧波地區(qū)88株細(xì)菌進(jìn)行耐藥基因的檢測(cè),結(jié)果頭孢類耐藥基因bla TEM的攜帶率為91.7%,四環(huán)素類耐藥基因tetB的檢測(cè)率為0,磺胺類sul2和氨基糖苷類strB的檢測(cè)率分別為16.7