重組多殺性巴氏桿菌細(xì)菌幽靈的研究.pdf

1、多殺性巴氏桿菌是幾種動物的重要病原菌，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本菌有5種不同的莢膜型和16種菌體型。引起牛和水牛出血性敗血癥的為B:2和E:2型，引起禽霍亂的為A:1和A:3型，在我國導(dǎo)致豬肺疫的菌株為B型，而國外致豬肺疫的是A型。能夠產(chǎn)生皮膚壞死毒素的A型和D型菌株是豬傳染性萎縮性鼻炎的重要病原菌之一，F(xiàn)型菌株則引起火雞不同程度的疾病。近年來，我國豬群由A型多殺性巴氏桿菌引起的豬肺炎病例逐漸增多。控制上述這些疾病的有效手段是免疫預(yù)防，但目前所有多

2、殺性巴氏桿菌的疫苗都存在著免疫期短和保護(hù)率相對偏低的問題。同種弱毒活疫苗比滅活疫苗免疫效力相對高些，這就預(yù)示著滅活疫苗在制備過程中的抗原決定族可能被物理和化學(xué)處理而破壞。通過遺傳滅活方法是保持天然抗原決定族的有效手段。為此，我們采用基因工程手段，從含有E基因的質(zhì)粒pHH43中提取E基因，并將其克隆到適合轉(zhuǎn)化野生型革蘭氏陰性菌的穿梭質(zhì)粒pPBA1100多克隆區(qū)，從而構(gòu)建新的裂解決質(zhì)粒，并以目前對養(yǎng)殖業(yè)危害較大的多殺性巴氏桿菌致病毒株為轉(zhuǎn)化

3、對象，構(gòu)建細(xì)菌幽靈重組菌株。通過比色法、CFU和掃描電鏡等分析，了解E裂解基因表達(dá)效果。利用免疫試驗(yàn)和攻毒試驗(yàn)評價多殺性巴氏桿菌幽靈的安全性。 結(jié)果如下： 1.經(jīng)大腸桿菌擴(kuò)繁后，帶有E基因和溫度誘導(dǎo)控制系統(tǒng)的質(zhì)粒pHH43，用限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切鑒定，瓊脂糖電泳出現(xiàn)5條譜帶，各譜帶分子量與理論值相符，提示E-基因與控制系統(tǒng)重組成功。 2.通過內(nèi)切酶Sac I水解質(zhì)粒pHH43獲得2條酶切片斷，回收的E-基

4、因盒片斷與穿梭質(zhì)粒pPBA1100雜交，構(gòu)建了E-基因表達(dá)質(zhì)粒pPBA1100-E。表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化構(gòu)建了多殺性巴氏桿菌重組菌株。內(nèi)切酶Sac I對重組菌株表達(dá)質(zhì)粒酶切后，E-基因盒片段與質(zhì)粒pUC19重組構(gòu)建了測序質(zhì)粒pUC19-E。E-基因盒測序結(jié)果表明，測定序列中包含E基因和控制系統(tǒng)c1857序列，同時表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶酶切鑒定，證明重組菌株構(gòu)建成功。 3.重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)，經(jīng)生長曲線和掃描電鏡檢測證明E-基因能在重組菌株中