禽多殺性巴氏桿菌莢膜和OmpH的關(guān)系其致病性研究.pdf

1、為了闡明禽多殺性巴氏桿菌莢膜和OmpH的關(guān)系及其致病性,本研究分別構(gòu)建pWSK29hexABC和pWSK29ompH兩個(gè)敲除載體,電轉(zhuǎn)化法將敲除載體導(dǎo)入禽巴氏桿菌強(qiáng)毒株C48-3中,篩選獲得C48-3hexABC和C48-3ompH缺失突變株,利用大腸桿菌-巴氏桿菌穿梭質(zhì)粒pPBA1101構(gòu)建互補(bǔ)株C48-3C。DNA測序結(jié)果顯示,突變株C48-3hexABC基因組中敲除了253bp的hexC基因下游序列、798bp的hexB基因全序列

2、和290bp的hexA基因上游序列,突變株C48-3ompH用四環(huán)素替換1062bpompH基因。使用交叉PCR以及RT-PCR結(jié)果顯示hexB基因和ompH基因缺失,不能正常轉(zhuǎn)錄;突變株C48-3hexABC、C48-3ompH與野生株C48-3形態(tài)一致,但突變株C48-3hexABC和C48-3ompH的生長速率慢;透視電鏡觀察突變株C48-3hexABC細(xì)菌表面無莢膜層,突變株C48-3ompH細(xì)菌表面的莢膜層不完整且較薄;C48

3、-3ompH不能表達(dá)39kDa的OmpH;Westernblot顯示抗天然OmpH抗體不能與C48-3ompH菌體蛋白特異性結(jié)合。突變株C48-3hexABC可正常轉(zhuǎn)錄ompH基因和突變株C48-3ompH正常轉(zhuǎn)錄hexB基因;突變株C48-3?hexABC和C48-3?ompH的fis基因的序列與野生株C48-3株和X-73株fis基因序列(AF067175)一致,未發(fā)生突變。結(jié)果表明,莢膜合成的缺失不影響OmpH的表達(dá),而OmpH缺

4、失影響莢膜的合成。
　　為了研究OmpH和莢膜在禽巴氏桿菌中的致病性。本研究采用小鼠毒力試驗(yàn)、粘附試驗(yàn)、粘附抑制試驗(yàn)、抗吞噬試驗(yàn)以及吞噬抑制試驗(yàn)。結(jié)果顯示野突變株C48-3hexABC毒力明顯減弱,突變株C48-3ompH組毒力相對減弱。突變株C48-3ompH對CEF細(xì)胞的附著能力顯著降低(P<0.01)?？箁OmpH抗體顯著抑制了野生株C48-3、突變株C48-3hexABC和互補(bǔ)株C48-3C對CEF細(xì)胞的粘附(P<0.01

5、),而抗rOmpH抗體對突變株C48-3?ompH粘附的抑制作用不明顯(P>0.05)。巨噬細(xì)胞對突變株C48-3?hexABC和突變株C48-3ompH的吞噬指數(shù)顯著高于野生株C48-3株和互補(bǔ)株C48-3C(P<0.01),抗OmpH抗體處理促進(jìn)巨噬細(xì)胞對突變株C48-3?hexABC的吞噬能力。研究結(jié)果表明莢膜是巴氏桿菌毒力因子,OmpH是具有粘附、抗吞噬能力的外膜蛋白。
　　本研究的結(jié)果為深入探討莢膜與外膜蛋白OmpH在禽