牦牛多殺性巴氏桿菌OmpH基因的原核表達(dá)及免疫效果評價.pdf

1、本文根據(jù)GenBank中巴氏桿菌外膜蛋白H(OmpH)基因核苷酸序列分別設(shè)計了含信號肽和去信號肽兩對特異性引物,通過PCR方法擴(kuò)增青海省牦牛源多殺性巴氏桿菌((Pasteurella mutocida, Pm)分離株P(guān)0910的OmpH基因,分別得到含信號肽的OmpH片段(HM)和成熟外膜蛋白H的OmpH基因,再分別克隆到pMD19-T Simple載體上,然后進(jìn)行序列測定和分析。結(jié)果表明,含信號肽的基因全長1005bp,包含一個完整的

2、開放閱讀框,編碼334個氨基酸,前20個氨基酸為信號肽序列。成熟外膜蛋白含有一個945bp的開放閱讀框,編碼314個氨基酸。
　　為了獲得可溶性的蛋白,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了不同表達(dá)載體的選擇。首先將成熟外膜蛋白H基因克隆到pET-32a載體和pCold I載體上,分別轉(zhuǎn)入BL-21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后得到的重組蛋白幾乎都以包涵體形式存在。然后將OmpH基因克隆到pMAL-c2x表達(dá)載體中,構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2x-OmpH,

3、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明:重組融合蛋白(MBP-OmpH)大小為76KDa,且以包涵體和可溶形式存在。將可溶形式的蛋白經(jīng)親和層析柱進(jìn)行純化,得到了純度較高的OmpH融合蛋白,Western-blot檢測結(jié)果表明,重組融合蛋白能與全菌滅活苗免疫血清發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　將純化的重組融合蛋白、外膜蛋白和滅活全菌制成疫苗免疫小鼠,同時設(shè)生理鹽水對照組。免疫三次,間隔均為兩周。每次免疫后第14天對每組

4、小鼠進(jìn)行斷尾采血并分離血清,通過ELISA檢測血清抗體效價。結(jié)果表明:重組蛋白組小鼠抗體水平明顯高于免疫組和對照組。免疫3次后對小鼠進(jìn)行攻毒,結(jié)果表明:重組融合蛋白、外膜蛋白和全菌滅活苗組小鼠均能抵抗菌株P(guān)0910的致死性攻擊,對小鼠的保護(hù)率達(dá)到90％,生理鹽水對照組則完全沒有保護(hù)。
　　綜上,本研究測定并分析了青海省牦牛源多殺性巴氏桿菌分離株P(guān)0910外膜蛋白H的基因序列,成功構(gòu)建了OmpH的可溶性原核表達(dá)系統(tǒng),獲得了重組融合蛋