牛源多殺性巴氏桿菌莢膜和毒力相關(guān)基因的克隆及序列分析.pdf

1、隨著規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和飼養(yǎng)密度的提高，疾病出現(xiàn)混合感染的機(jī)會(huì)越來(lái)越多，許多細(xì)菌扮演著繼發(fā)感染的角色，多殺性巴氏桿菌就是其中一員。2007年，新疆石河子先后有6個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)1-9周齡犢牛突然發(fā)病，共有90余頭犢牛死亡，通過(guò)臨床癥狀以及病原菌的分離鑒定，診斷為多殺性巴氏桿菌引起的犢牛肺炎。為追溯病原，更有效地控制該病的發(fā)生，本研究從犢牛肺炎發(fā)生牛場(chǎng)采集了健康犢牛鼻腔棉拭，通過(guò)對(duì)細(xì)菌的分離、生化鑒定、藥敏實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及PCR方法的檢測(cè)，

2、得到了2株多殺性巴氏桿菌。對(duì)所分離得到的多殺性巴氏桿菌以及實(shí)驗(yàn)室保存的致?tīng)倥７窝锥鄽⑿园褪蠗U菌莢膜和毒力相關(guān)基因hasR、ompH、plpE、ptfA進(jìn)行克隆測(cè)序及序列分析，以便進(jìn)一步調(diào)查致?tīng)倥７窝装褪蠗U菌病的傳染源，為研究多殺性巴氏桿菌的致病機(jī)理，相關(guān)基因的分子特性以及表達(dá)奠定基礎(chǔ)。結(jié)果如下：
　　 1、鼻腔棉拭分離的2株生化鑒定結(jié)果、分離菌形態(tài)特征及培養(yǎng)特性與多殺性巴氏桿菌一致。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)為24小時(shí)內(nèi)實(shí)驗(yàn)小鼠全部死亡，表現(xiàn)

3、很強(qiáng)的致病性，并可以從死亡的小鼠體內(nèi)分離得到所感染菌，組織染色可明顯觀察到兩極濃染現(xiàn)象。
　　 2、參考Townsend發(fā)表的多殺性巴氏桿菌種特異性基因引物以及血清型特異性基因引物，以2株分離菌的DNA為模板，通過(guò)多重PCR擴(kuò)增，結(jié)果可以擴(kuò)增出500bp和1000bp左右的兩條帶，回收后測(cè)序并在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，顯示分別與多殺性巴氏桿菌種特異性基因和莢膜血清A型基因同源性都在99%以上。
　　 3、藥敏

4、試驗(yàn)表明，健康牛鼻腔棉拭分離得到的2株P(guān)m對(duì)新霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星表現(xiàn)高敏，對(duì)氨芐青霉素鈉、頭孢拉定、卡那霉素、頭孢噻呋鈉、阿米卡星表現(xiàn)耐受。
　　 4、通過(guò)對(duì)莢膜和毒力相關(guān)基因hasR、ompH、plpE、ptfA的序列克隆與分析表明， Pm-BS-d、Pm-BS-a、Pm142-x-4、Pm142-x-3、Pm149-x、Pm149-xby之間同源性為82.2%-100%，這些基因在不同多殺性巴氏桿菌