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文檔簡介
1、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)在世界各地分布非常廣泛,在畜禽中帶菌率較高,有資料指出,豬的鼻道深處和喉頭內(nèi),帶菌率為30.9%。產(chǎn)毒素多殺性巴氏桿菌(Toxigenic Pasturella multocida T Pm)能導(dǎo)致進(jìn)行性萎縮性鼻炎。進(jìn)行性萎縮性鼻炎被列為規(guī)?;B(yǎng)豬五大傳染病之一,并被國際獸疫局(Office International Des Epizooties,OIE)定為B類動(dòng)物傳
2、染病。我國因引種而帶進(jìn)本病,現(xiàn)已在我國許多省、市(區(qū))有不同程度的發(fā)生和流行。 隨著集約化程度的不斷提高,該病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害也曰趨嚴(yán)重,我國豬傳染性萎縮性鼻炎的發(fā)病率高達(dá)60%以上,已造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。T<'+>Pm是進(jìn)行性萎縮性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis,PAR)的主要病原菌,檢測、分離T<'+>Pm是診斷和控制該病的關(guān)鍵。基于產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素(Pasteurella multoc
3、idatoxin,PMT)的特性,已經(jīng)建立了一些實(shí)驗(yàn)方法,如豚鼠皮膚壞死實(shí)驗(yàn)、小鼠致死實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞促生長實(shí)驗(yàn)、胎牛肺細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、ELISA等,來檢測T<'+>Pm。但這些方法,無論是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還是細(xì)胞培養(yǎng)都必須首先分離出T<'+>Pm??梢姴僮鞣爆?、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力,臨床上應(yīng)用有很大的局限性,而PCR診斷方法具有特異、快速、敏感等優(yōu)點(diǎn),可以不進(jìn)行T<'+>Pm的分離即可對(duì)產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌病進(jìn)行診斷,簡單、快捷、準(zhǔn)確。 本試驗(yàn)根據(jù)Gen
4、Bank上報(bào)道的產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌toxA的基因序列,選擇其保守序列作為擴(kuò)增區(qū)域。利用Oligo 6.0和Primet Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)篩選出適合的一對(duì)PCR引物,擴(kuò)增片段為338bp,并成功的連接到pGEM-T Easy載體上,構(gòu)建了含有產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌特異基因片斷的重組質(zhì)粒,經(jīng)限制性內(nèi)切酶Not Ⅰ酶切分析、PCR鑒定以及序列分析,驗(yàn)證所克隆的基因?yàn)楫a(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌特異性基因,建立了產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌病的PCR診斷
5、方法。測得的標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌特異基因序列與本地分離的產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌特異基因序列同源性為97.94%,特異性和敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明,該診斷序列不能擴(kuò)增出金黃色葡萄球菌、鏈球菌、沙門氏桿菌、大腸桿菌、敗血性波氏桿菌的DNA;當(dāng)樣本中產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌DNA含量為432.6fg/μl時(shí),仍可擴(kuò)增出清晰可辨的條帶。利用PCR技術(shù)對(duì)55頭份來自延邊地區(qū)的鼻拭子樣本進(jìn)行檢查,檢出率為16.36%,所建立的PCR診斷方法具有特異、快速、敏感等
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