牛源多殺性巴氏桿菌PlpB、OmpH和OmpA重組蛋白的表達及免疫保護性研究.pdf

1、在養(yǎng)牛生產(chǎn)中，牛出?。╤emorrhagic septicemia of cattle）是一種很重要的急性、接觸性和敗血性傳染病，由多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)引起，這種致病菌具有條件性致病特征。某些情況下，牛感染Pm后會發(fā)展成為肺炎。由于廣泛流行這種疾病，我國的養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)受到極為嚴重的影響。目前國內還未研發(fā)出行之有效的Pm的疫苗，這種細菌異型之間的交叉保護性極低，無法對Pm進行有效的防控。因此，需要

2、研發(fā)能夠提供交叉保護性并且安全有效的新疫苗。
　　從目前的相關研究中發(fā)現(xiàn)，外膜蛋白OmpA和OmpH，以及脂蛋白PlpB是具有抗原性的，并且 OmpH蛋白作為細菌成孔蛋白（porin）可優(yōu)先識別疏水性物質，親和力很高，具有參與免疫啟動的重要作用。OmpA是一種具有相對保守性與免疫原性的膜蛋白，可粘附于細胞外基質激發(fā)動物機體的體液免疫與細胞免疫。PlpB蛋白位于Pm細胞的外表面，能誘導動物機體產(chǎn)生免疫反應，有一定的血清間的交叉保護性

3、。因此對這三個蛋白進行引物設計和基因的擴增，構建原核表達載體，進行蛋白表達純化，最后通過小鼠的攻毒免疫保護性實驗檢驗重組蛋白的免疫保護效果，具體研究工作如下：
　　1.提取高純度Pm基因組,擴增基因PlpB、OmpA和OmpH，然后先構建到pMD-18T上。經(jīng)酶切鑒定，構建成功的質粒送公司測序。在NCBI上對測序結果進行比對，結果顯示構建到載體上的基因為實驗需要的目的基因，對目的基因序列進行簡單的分析。
　　2.將基因Plp

4、B、OmpA和OmpH構建到PET-32A載體上，酶切鑒定成功送公司測序并對測序結果進行比對驗證。若質粒上的目的基因未發(fā)生突變，將構建成功的PET-32A-OmpA/OmpH/PlpB質粒轉化進入宿主菌BL21的菌體內，進行蛋白的表達驗證。經(jīng)過反復驗證后重組蛋白OmpA和OmpH表達在包涵體。包涵體蛋白用8mol/L的尿素（含有50nmol/L的Tris）溶解變性，通過透析來逐漸降低尿素濃度，使重組蛋白復性可溶；重組蛋白PlpB表達在菌

5、體上清，此蛋白純化則通過His標簽Ni-NTA層析柱進行純化，用SDS-PAGE進行電泳、染色和脫色觀察到目的蛋白大小位置有清晰條帶，雜帶較少。又經(jīng)過Western-blot檢測確定純化到的確為重組目的蛋白。將純化后的蛋白進行濃縮，根據(jù)在酶標儀上測得的蛋白標準曲線計算蛋白濃度，計算結果顯示蛋白量達到制備疫苗的要求。用全菌免疫的小鼠陽性血清，對重組蛋白進行抗原特異性檢測，結果表明 PlpB、OmpA和 OmpH都具有抗原性。
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6、.純化后的重組蛋白與滅活的全菌加入佐劑乳化后制備成疫苗，然后對小鼠進行免疫，并且設置空白對照。免疫兩次，中間間隔兩周。免疫后兩周采血，取血清后用ELISA的方法檢測抗體。結果顯示重組蛋白疫苗組的抗體水平明顯高于空白組。免疫保護試驗結果顯示重組蛋白疫苗組保護率較低，但重組蛋白疫苗組的小鼠存活時間相對明顯延長，并且，全血殺菌實驗與組織載菌量的結果顯示小鼠體內的血清抗體有明顯抑制多殺性巴氏桿菌增長的作用，說明重組蛋白OmpA、OmpH和Plp